Study on the Treatment of Qi Deficiency and Blood Stasis Syndrome of Coronary Heart Disease Angina Pectoris with Sofren Injection Based on Disease Module Analysis
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摘要:目的
揭示大株红景天注射液治疗冠心病心绞痛气虚血瘀证的药理机制，并运用细胞实验初步验证预测结果的可靠性。
方法从生物医学数据库和国内外文献中筛选出大株红景天注射液的主要化学成分及其作用靶点；通过GeneCards数据库、MalaCards数据库筛选出气虚血瘀证、心绞痛基因，采用DIAMOnD算法构建心绞痛疾病模块；对“心绞痛-气虚血瘀证-大株红景天注射液”网络的核心靶点进行基因功能富集分析，得到关键通路。最后，进行细胞实验验证大株红景天注射液对缺氧H9C2心肌细胞关键通路蛋白表达的影响。
结果筛选出大株红景天注射液主要的化学成分7个，共获得靶点362个；筛选出232个已知心绞痛基因，通过构建心绞痛疾病模块，增加了100个预测得到的心绞痛基因；得到气虚血瘀证症状相关基因2 960个。网络拓扑分析得到大株红景天注射液治疗冠心病心绞痛气虚血瘀证的核心靶点有STAT3、EGFR、TNF、IL-6等共30个；基因功能富集分析获得通路82条。结合以往文献研究分析显示STAT3靶点和JAK2/STAT3通路可能是大株红景天注射液治疗冠心病心绞痛气虚血瘀证的关键作用通路。细胞实验结果显示，与模型组比较，SI组及尼可地尔组JAK2、STAT3的mRNA表达均显著降低(P < 0.05)；JAK2、STAT3的蛋白表达显著下降(P < 0.05)。
结论通过疾病模块和细胞实验验证发现STAT3是冠心病心绞痛气虚血瘀证病理机制的关键基因，JAK2/STAT3是大株红景天注射液治疗冠心病心绞痛气虚血瘀证的核心通路，表明了本研究结合疾病模块进行药物治疗病证的有效性和新颖性。
Abstract:OBJECTIVETo reveal the pharmacological mechanism of Sofren Injection in the treatment of Qi deficiency and blood stasis syndrome of angina pectoris in coronary heart disease, and to preliminarily verify the reliability of the prediction results by cell experiments.
METHODSFirstly, we screened the main chemical components of Sofren injection and their targets from biomedical databases and literature. Then, using the DIAMOnD algorithm, we constructed the angina disease module by screening Qi deficiency and blood stasis syndrome-related genes from the GeneCards and MalaCards databases. Next, we conducted gene functional enrichment analysis of the core targets in the "angina pectoris-Qi deficiency and blood stasis-Sofren Injection" network to identify key pathways. Finally, we performed cell experiments to verify the effect of Sofren Injection on the expression of key pathway proteins in hypoxic H9C2 cardiomyocytes.
RESULTSWe identified 7 main chemical components of Sofren Injection, targeting a total of 362 genes. We screened 232 known angina pectoris-related genes and added 100 predicted genes by constructing the angina pectoris disease module. A total of 2 960 genes related to Qi deficiency and blood stasis syndrome were obtained. Network topological analysis revealed 30 core targets for Sofren Injection in treating coronary heart disease angina pectoris with Qi deficiency and blood stasis syndrome, including STAT3, EGFR, TNF, and IL-6. Gene functional enrichment analysis identified 82 pathways. Literature analysis combined with the results indicated that STAT3 and the JAK2/STAT3 pathway might be key pathways for Sofren Injection in treating coronary heart disease angina pectoris with Qi deficiency and blood stasis syndrome. Cell experimental results showed significant decreases in mRNA and protein expression of JAK2 and STAT3 in the SI group and the nicorandil group compared to the model group (P < 0.05).
CONCLUSIONDisease module analysis and cell experiments confirm that STAT3 is a key gene in the pathological mechanism of coronary heart disease angina pectoris with Qi deficiency and blood stasis syndrome, and the JAK2/STAT3 pathway is a core pathway for Sofren Injection in treating this condition. This study demonstrates the effectiveness and novelty of combining disease module for mining the treatment of TCM formulas with specific disease and syndrome.
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冠心病心绞痛(AP)是因冠状动脉供血不足心肌短暂性缺血缺氧引起胸闷、胸痛的症状，是冠状动脉粥样硬化性心脏病最常见的临床表现[1]。中医理论认为不同体质的人群患冠心病心绞痛会出现不同兼症，这就是疾病的不同证型[2]，根据不同证型给予对症的药物可以更有效的治疗疾病。中医认为冠心病心绞痛存在不同证型，其中，气虚血瘀证是冠心病心绞痛最常见的证型[3]。气虚血瘀证以胸闷、气短、乏力、心悸、舌紫暗、脉细涩等为主要临床表现[4]。大株红景天注射液是由大株红景天经提取、分离、精制、膜过滤制成而成[5]的单药注射液，具有益气固本、活血化瘀的功效。临床应用大株红景天注射液治疗冠心病心绞痛气虚血瘀证已有15年余，其疗效显著、安全性高[6]。多项临床随机对照实验表明，大株红景天注射液能够降低冠心病心绞痛患者血清ICAM-1、IL-6、hs-CRP、PT、APTT、FIB和MMP-9的水平，改善患者胸闷、气短、心悸等症状[7-9]。尽管大株红景天注射液对冠心病心绞痛气虚血瘀证的治疗效果已被证明，但是其作用机制尚不清晰。
网络药理学是通过高通量组学数据分析、计算机模拟等现代化技术，结合生物学、基因组学、蛋白组学等多学科理论，系统揭示“药物-靶点-疾病”相互作用的网络关系，是明确药效物质基础、预测药物作用机制的一门新兴学科[10]。目前网络药理学方法已被广泛运用到中医药领域的研究[11]，如中药成分的分析[12]，中医疾病的病理机制[13-14]、中药治疗疾病的作用机制[15-16]等。然而，这些研究主要是基于对疾病和药物的交集基因进行网络拓扑分析和基因功能分析，从而展现出药物与疾病的联系。这种方法局限于当下的研究水平，不能全部找出与疾病有关的基因，因此，网络药理学研究结果的准确性受到了限制[17]。疾病模块的研究正是将已知的疾病基因作为种子基因，运用DIAMOnD算法在蛋白质相互作用网络(PPI)中分析出与疾病联系紧密的包括已知和未知的所有基因，补充了原有疾病基因的不完备性[11]。运用疾病模块筛选出更全面更核心的疾病基因作为研究基础，可以有效弥补现有网络药理学研究的不足，从而更精确的阐释药物治疗疾病的作用机制。
中医通过病证结合的角度认识疾病，认为同一种疾病因人体气血阴阳的不同而分为不同的证型。比如冠心病心绞痛可以分为气虚血瘀证、痰湿内阻证、痰热扰心证等[12]，不同的证型有不同的治疗方法，这与西医用同一类药物治疗同一种疾病有所不同。当前对中医治疗疾病机制的网络药理学研究仍停留于对疾病层面的分析，而没有涉及到中医证型的水平。因此，将疾病和中医证候相关的基因纳入网络药理学机制研究中，即病证结合研究模式，更符合中医研究规律，得出的预测结果可能更精准。
本研究采用心绞痛疾病模块方法，从病证结合的角度运用网络药理学方法对大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证的病理机制进行探讨，并通过细胞实验对结果进行初步验证；为大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证提供理论依据，为中药治疗疾病的作用机制探索新的研究方法(图 1)。
1. 材料与方法
1.1 网络药理学研究
1.1.1 大株红景天注射液主要成分及作用靶点筛选
查阅国内外文献及检索中医药综合数据库(TCMID，http://www.megabionet.org/tcmid/)确认大株红景天注射液的主要化学成分，通过Pubchem数据库检索得到化学成分的Canonical SMILES字符串(每个化合物的唯一SMILES字符串)；将SMILES字符串输入SwissTarget数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，检索、合并、去重后得到大株红景天注射液的作用靶点。
1.1.2 心绞痛相关基因筛选
将心绞痛相关英文名称“Angina”“Unstable angina”输入GeneCards数据库，检索并筛选出最相近病名“Angina”，将最相近病名输入MalaCards数据库，检索出心绞痛的相关基因(Genes for Angina pectoris)。
1.1.3 气虚血瘀证相关基因筛选
根据《中药新药临床研究指导原则》[18]确定气虚血瘀证的症状群，通过GeneCards数据库检索并筛选出每种症状最相近病名、将最相近病名输入MalaCards数据库检索出每种症状的相关基因，如乏力“weakness”、气短“shortness of breath”等。
1.1.4 心绞痛疾病模块的构建
将心绞痛现有基因作为种子基因，采用DIAMOnD算法来构建心绞痛疾病模块。DIAMOnD算法预测了PPI中与输入疾病基因密切相关的其他基因。将原有基因与预测基因结合，形成蛋白网络水平的心绞痛疾病模块。具体而言，本研究以冠心病心绞痛的现有基因(即种子基因)作为输入，映射到PPI网络中，在PPI网络背景下基于DIAMOnD算法迭代一轮形成1个新增基因，并将此新增基因加入原始基因中，再次迭代算法形成新增基因，以此方式迭代若干轮，直至新增基因的显著性P值不满足P < 0.05的条件或候选基因集为空时停止迭代。
1.1.5 “病-证-药”分子网络构建
将心绞痛、气虚血瘀证、大株红景天注射液的基因合并去重，将去重后的基因列表导入STRING数据库(https://www.string-db.org/)，选择物种为“Homo sapiens”，条件设为“Combined score > 0.7”，下载PPI网络数据并导入CytoScape软件，进一步构建PPI网络图。利用CytoScape软件中“Tools”(工具栏)下“Network analyzer”选项进行网络拓扑结果分析。根据度值及相关性进一步分析“病-症-药”的核心靶点。
1.1.6 “病-证-药”KEGG富集分析和基因功能(GO)分析
将“病-证-药”基因的交集作为输入，调用SymMap数据库(https://www.symmap.org/)接口进行KEGG富集分析，GO功能分析。GO功能分析主要包括生物过程(Biological process, BP)、细胞组成(Cellular component，CC)以及分子功能(Molecular function，MF)。筛选KEGG和GO富集分析前20项结果制成可视化气泡图。
1.2 体外实验研究
1.2.1 实验材料
1.2.1.1 实验细胞
H9C2心肌细胞系购买于国家实验细胞资源共享平台(北京协和细胞资源中心，中国)，是乳鼠心肌细胞系。
1.2.1.2 药物与试剂
大株红景天注射液(Z20060362，通化玉圣药业有限公司)，尼可地尔(H41024517，天方药业有限公司)，胎牛血清(批号：10099141C，Gibico)，JAK2(货号：60225-1-lg，proteintech)、STAT3(货号：10253-2-AP，proteintech)、MASSON染色试剂盒(批号：G1346，索莱宝)，FITC试剂盒(批号：CA1620，索莱宝)等。
1.2.1.3 实验仪器
TS2R-FL型倒置荧光显微镜(日本尼康)，CPOCH型全波长酶标仪(美国Bio-tek)，160i型三气培养箱(德国Thermo Fisher SCIENTIFIC)，Revolve FL型正倒置一体荧光显微镜(美国Echo)。
1.2.2 实验方法
1.2.2.1 细胞培养与造模
从液氮罐中取出细胞株进行复苏，用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的DMEM高糖培养基培养H9C2心肌细胞，将培养瓶静置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。当传代至2~3代时，观察细胞的生长状态。细胞培养状态良好，将细胞按照5×104 mL-1，分别接种于96孔板，当细胞生长至80%饱和度时，正常组细胞放在普通CO2培养箱，将模型组细胞放在三气培养箱中进行1、4、12、24、30 h缺氧造模，根据细胞存活率选择最佳造模时间。
1.2.2.2 细胞分组
实验分为正常组、模型组、大株红景天注射液组(SI组)和尼可地尔组。正常组：DMEM高糖培养基普通CO2培养箱24 h；模型组：三气培养箱缺氧缺糖干预造模培养24 h；SI组：缺氧缺糖培养，CCK8法摸索大株红景天注射液最佳浓度后，干预24 h；尼可地尔组：缺氧缺糖培养，CCK8法摸索药物作用最佳浓度后干预24 h。
1.2.2.3 qPCR法检测JAK2、STAT3 mRNA的表达水平
在各组细胞中加入1 mL裂解液，采用离心柱法提取总RNA，进行浓度和纯度测定，选取2 μg总RNA进行逆转录，反应体系为20 μL。运用qPCR法扩增，40个循环结束后参照基因ΔΔCt法计算目的基因mRNA表达的相对含量。所用引物由江苏金唯智公司合成，序列见表 1。
表 1 荧光定量PCR的引物Table 1. Primers of fluorescence quantitative PCR引物名称 序列 退火温度/℃ JAK2 F: CTGGCTGTCTATAACTCCATCAG 60 JAK2 R: CCTGCGGAATCTGTACCTTATC Stat3 F: ACCCAGATCCAGTCTGTAGAA 60 Stat3 R: GGAATGTCAGGGTAGAGGTAGA β-actin F: ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT 60 β-actin R: CCAGAGGCATACAGGGACAA 1.2.2.4 蛋白质免疫印迹检测JAK2、STAT3蛋白的表达水平
提取用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂鸡尾酒的RIPA裂解缓冲液提取细胞蛋白。用BCA测定蛋白浓度。40 μg总蛋白在10% SDS聚丙烯酰胺凝胶上溶解，并转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。转移后，用5%脱脂牛奶封闭膜，然后将PVDF与一抗(兔抗STAT3、1 ∶ 1 000；兔抗JAK2、1 ∶ 1 000；兔抗β-actin，1 ∶ 30 000)在4 ℃下孵过夜，TBST洗膜5 min×5次，PVDF膜与辣根过氧化物酶偶联抗体一起孵育(1 ∶ 10 000，室温下孵育1 h)。最后，使用ECL观察条带，并使用多功能成像系统进行成像。以β-actin的表达作为内源性对照。
1.2.2.5 统计学方法
实验数据以x±s表示，用统计学软件SPSS 27.0进行统计学分析。多组间比较，数据呈正态分布，且方差齐时运用单因素方差分析，两组间比较用LSD检验；数据非正态分布或/方差不齐时采用非参检验或单因素方差分析Dunnett's T3法进行，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 网络药理学结果
2.1.1 大株红景天注射液主要成分及作用靶点筛选
检索得到大株红景天注射液主要化学成分7个，分别是红景天苷、没食子酸、酪醇、对羟基苯甲酸、对香豆酸、络塞定和对羟基苯甲醛。分别筛选出有效靶点红景天苷107个、没食子酸100个、酪醇111个、对羟基苯甲酸104个、对香豆酸102个、络塞定109个和对羟基苯甲醛81个，合并去重后得到362个靶点。
2.1.2 心绞痛、气虚血瘀证相关基因筛选
根据GeneCards数据库筛选出与“心绞痛”“气虚血瘀证”相关症状最相近的名词，将最这些名词输入MalaCards基因数据库再次检索，共筛选出基因心绞痛232个，气虚血瘀证相关基因2 960个。其中气虚血瘀证相关症状所涉及的基因数目统计如下表 2所示。
表 2 气虚血瘀证主要症状基因数目统计Table 2. Statistics of the number of genes of Qi deficiency and blood stasis syndrome main symptoms症状 基因计数 乏力 537 喘憋 2 106 心悸 70 气短 222 胸痛 167 血瘀 10 2.1.3 心绞痛疾病模块的构建
将已获取的232个心绞痛基因作为种子基因，运用DIAMOnD算法对候选节点进行排序，考虑到心绞痛种子基因数目以及预测基因的显著性P值情况，本研究进行了100次迭代，得到算法预测的100个基因作为新增基因，其中包含了基因的名称及其对应的P值。随后，我们将这100个基因与已有的232个基因结合起来并导入到STRING数据库中，形成一个PPI分子网络，作为最终的心绞痛疾病模块，共获取332个心绞痛基因。新生成的100个基因中前20个基因，按P值升序排列，如表 3所示。
表 3 DIAMOnD算法新筛选出的前20位基因Table 3. Top 20 genes newly selected by DIAMOnD algorithm排序 基因名称 P值 排序 基因名称 P值 1 ALB 3.47E-54 11 CCL4 5.21E-40 2 CD4 1.34E-45 12 CD8A 3.39E-39 3 STAT3 1.03E-42 13 IL15 2.09E-39 4 FN1 3.75E-41 14 IL9 1.66E-39 5 IL13 2.99E-40 15 ITGAX 2.06E-38 6 CXCL1 2.66E-41 16 CCL4L1 9.25E-36 7 CSF2 2.46E-41 17 CCR5 1.45E-35 8 VCAM1 2.61E-40 18 CD86 1.08E-36 9 PTPRC 1.48E-41 19 CTLA4 1.93E-36 10 CSF3 6.02E-39 20 CD40 6.67E-38 值得注意的是，所有100个新生成的基因P值均远低于0.05，证明了DIAMOnD算法生成的结果具有统计学意义。形成的冠心病心绞痛疾病模块的分子网络可视化展示如图 2所示，其中浅蓝色节点表示冠心病心绞痛的已有基因(种子基因)，紫色节点表示经过DIAMOnD算法预测得到的新增基因，图中节点的大小代表了节点的度值。表 4展示出了模块中根据度值降序排在前20的节点的拓扑属性情况(其中ASPL为平均最短路径距离，BC为介数中心性，CC为接近中心性，NC表示邻域连通性)，从表中可以看出，IL-6、TNF、IL-10、STAT3等基因在疾病模块中的网络集中性较为显著，特别是对于STAT3、CD4、CSF2等经过DIAMOnD算法预测得到的相关基因，这些基因与心绞痛的种子基因之间具有较高的网络关联性，这也体现出本研究结合DIAMOnD算法新增基因进行疾病模块构建的有效性。
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图 2 冠心病心绞痛疾病模块注：图中浅蓝色节点表示冠心病心绞痛的已有基因(种子基因)，紫色节点表示经过DIAMOnD算法预测得到的新增基因。图中节点的大小代表了节点的度值。Figure 2. Disease module of coronary heart disease angina pectoris表 4 冠心病心绞痛疾病模块基因拓扑属性(根据度值降序前20名)Table 4. Gene topological attributes of disease module of coronary heart disease angina pectoris (top 20 in descending order of degree value)基因名称 标签 度值 ASPL BC CC NC IL6 种子基因 137 1.538 5 0.068 0 0.650 0 43.956 2 TNF 种子基因 122 1.593 4 0.058 1 0.627 6 45.836 1 IL10 种子基因 120 1.644 7 0.031 3 0.608 0 47.416 7 STAT3 预测基因 108 1.681 3 0.047 6 0.594 8 46.398 1 IL1B 种子基因 105 1.685 0 0.031 0 0.593 5 48.476 2 CD4 预测基因 102 1.728 9 0.043 9 0.578 4 48.313 7 IL4 种子基因 98 1.765 6 0.015 3 0.566 4 51.081 6 CXCL8 种子基因 90 1.780 2 0.021 5 0.561 7 52.366 7 CCL2 种子基因 90 1.765 6 0.025 2 0.566 4 52.244 4 IFNG 种子基因 85 1.805 9 0.009 6 0.553 8 53.670 6 IL2 种子基因 84 1.805 9 0.010 7 0.553 8 53.690 5 CSF2 预测基因 82 1.860 8 0.007 4 0.537 4 54.939 0 CXCL10 种子基因 81 1.912 1 0.008 5 0.523 0 54.172 8 IL17A 种子基因 81 1.838 8 0.010 1 0.543 8 53.246 9 CCL5 种子基因 77 1.897 4 0.008 5 0.527 0 55.922 1 IL13 预测基因 77 1.882 8 0.014 0 0.531 1 51.987 0 CCL3 种子基因 72 1.959 7 0.007 5 0.510 3 56.611 1 CCL4 预测基因 71 1.948 7 0.007 1 0.513 2 57.070 4 ITGAM 种子基因 70 1.890 1 0.022 1 0.529 1 50.728 6 CXCR4 种子基因 67 1.882 8 0.021 6 0.531 1 46.358 2 2.1.4 “病-证-药物”分子网络构建
首先，根据心绞痛疾病模块和气虚血瘀证的相关基因形成“心绞痛-气虚血瘀证”网络，其可视化结果如图 3所示。其中紫色节点表示心绞痛与气虚血瘀证的基因交集，共264个，浅蓝色节点表示除交集外的心绞痛剩余基因，黄色节点表示除交集外的气虚血瘀证剩余基因。将“病-证”网络根据度值的大小进行排序，度值排名前十位且为“病-证”交集基因的有STAT3、EGFR、TNF、IL-6、PIK3R1，这5个基因与“病-证”联系最为紧密，可能是心绞痛气虚血瘀证发病机制的核心基因。
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图 3 “心绞痛-气虚血瘀证”分子网络可视化Figure 3. Visualization of molecular network of "angina pectoris-Qi deficiency and blood stasis syndrome"在此基础上，我们利用264个“心绞痛-气虚血瘀证”的交集基因与362个大株红景天注射液的靶点合并形成“心绞痛-气虚血瘀证-大株红景天注射液”网络，如图 4所示。其中深紫色30个节点为疾病(心绞痛)、证候(气虚血瘀证)与药物(大株红景天注射液)的共同交集基因，浅紫色为心绞痛与气虚血瘀证除交集节点外的其他交集基因，浅绿色为大株红景天注射液除交集以外的其他靶点。根据中心相关性排名获得前十位基因的拓扑属性指标，STAT3不仅度值排名首位，并且为“病-证-药”的交集基因，因此，它可能是大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证的最关键靶点。
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图 4 “病-证-药”分子网络可视化Figure 4. Visualization of molecular network of "disease-syndrome-drug"2.1.5 “病-证-药”基因功能富集分析
我们首先筛选出“病-证-药”的交集基因(即30个交叉基因，形成了图 5(a)所示的分子网络。在这30个基因中，深紫色突出显示的24个基因代表源自心绞痛的种子基因，DIAMOnD算法识别了其余6个粉红色基因。6个新增基因表现出相对较高的度，并与其他24个节点表现出密切的关系。在30个靶点基础上，通过SymMap进行了基因功能富集分析，共富集到82条通路(图 5b显示了前十条富集结果，按P值升序排列)。在图 5c的气泡图中展示前20个富集结果。GO富集分析结果包括三个不同水平：BP、MF和CC。BP类别包括对酶结合的反应、炎症反应、与生长激素有关的JAK-STAT级联反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控和凝血。CC类GO术语包括EGFR因子、脂多糖受体、细胞表面和细胞核。MF类别中的GO是一氧化氮合酶活性、药物结合、蛋白质结合和酶结合，见图 5(d)。
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图 5 “病-证-药”基因功能富集分析注：a.“病-证-药”的核心基因可视化网络图，其中紫色基因表示核心基因与现有疾病基因重叠的基因，粉色基因表示与新增疾病基因重叠的基因；b.基因富集分析通路表；c.基因富集分析通路气泡图；d.GO-BP富集分析的气泡图。Figure 5. Gene function enrichment analysis of "disease-syndrome-drug"2.2 体外验证实验结果
2.2.1 细胞缺氧缺糖模型的建立及药物最佳作用浓度的选择
正常组细胞，随着造模时间延长，光密度值增加，模型组细胞，造模时间为1、4、8、12、24、30 h，细胞存活率为1 h(94.35%)，4 h(93.85%)，8 h(88.48%)，12 h(64.43%)，24 h(45.38%)，30 h(35.02%)，初步选定造模时间24 h，此时细胞存活率为50%左右。通过CCK8检测法，最终检测到大株红景天注射液对细胞保护的最佳作用浓度为6%，尼可地尔片的最佳保护作用浓度为100 μmol·L-1，如图 6。
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图 6 造模时间选择、大株红景天注射液最佳浓度选择与尼可地尔最佳浓度的选择注：与正常组比较，**P < 0.01；与模型组比较，##P＜0.01。Figure 6. Selection of modeling time, selection of optimal concentration of Sofren Injection and selection of optimal concentration of Nicorandil2.2.2 大株红景天注射液对缺氧心肌细胞JAK2、STAT3 mRNA表达水平的影响
与正常组比较，模型组中缺氧心肌细胞JAK2、STAT3蛋白及mRNA的表达升高，差异有统计学意义(P < 0.01)；与模型组比较，SI组和尼可地尔组JAK2、STAT3蛋白及mRNA的表达显著降低(P < 0.01)；SI组与尼可地尔组相比较，以上两项数值差异没有统计学意义(P>0.05)，结果见图 7。
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图 7 各组缺氧心肌细胞中JAK2、STAT3mRNA的表达情况注：与模型组比较，**P < 0.01。Figure 7. Expression of JAK2 and STAT3 mRNA in hypoxic myocardial cells of each group2.2.3 大株红景天注射液对缺氧心肌细胞JAK2、STAT3 mRNA蛋白表达的影响
与正常组比较，模型组中缺氧心肌细胞JAK2、STAT3蛋白的表达升高，差异有统计学意义(P < 0.01)；与模型组比较，SI组和尼可地尔组JAK2、STAT3蛋白的表达显著降低(P < 0.01)；SI组与尼可地尔组相比较，以上两项数值差异没有统计学意义(P>0.05)。见图 8。
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图 8 各组蛋白表达情况注：a.各组缺氧心肌细胞中JAK2、STAT3蛋白表达比较；b.不同组细胞中JAK2蛋白的表达情况；c.不同组细胞中STAT3蛋白的表达情况。与模型组比较，**P < 0.01。Figure 8. Protein expression of each group3. 讨论
网络药理学突破了“单药-单靶点”的研究模式，从系统生物学及生物网络平衡的角度通过分析药物、靶点、疾病之间的关系来揭示药物治疗疾病复杂的病理生理过程[19, 20]。然而，网络药理学的现有研究主要集中将疾病和药物的交集基因作为核心靶点，这种方法过度依赖于从交集中获得的“核心靶点”，这些靶点通常偏向于蛋白质-蛋白质相互作用网络中的枢纽节点，无法全面反映所研究疾病的核心机制。疾病模块的概念源于网络医学[21]，具有重要意义，它是指与某一疾病相关的蛋白或基因并非随机分散在网络中，而是在一套核心组织原则的关联下形成相互联系的功能亚群[22]。疾病模块的构建使疾病基因得到了网络级扩展，使这些疾病基因之间的相互连接形成一个或多个子网络[23]。疾病模块的研究方法从网络的角度更全面、更多维度地揭示疾病的作用机制，有效弥补了网药研究的不足。故本研究创新性的运用网络药理学结合疾病模块的研究方法，通过疾病模块预测了心绞痛相关基因，并筛选出了大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证的核心通路。
本研究以心绞痛现有基因作为种子基因，采用DIAMOnD算法构建心绞痛疾病模块，最终得到332个心绞痛基因。我们首次利用心绞痛疾病模块与中医气虚血瘀证基因构建网络，并对网络中的基因进行全面分析，度值反映了基因之间的关联频次，度值越大的基因，表明与“病-证”联系越为紧密。我们发现STAT3、EGFR、TNF、IL-6、PIK3R1，这5个基因是度值排名前十位且为“病-证”交集的基因，因此，它们可能是心绞痛气虚血瘀证发病机制的核心基因。Chang等[24]的研究表明，IL-6、AKT1、STAT3可能是心绞痛气虚血瘀证的核心基因，这与本研究结论相一致。Bi等[25]基于网络药理学与分子对接技术探索发现，与心绞痛发病机制相关的基因有IL-6、PTGS2、VEGFA、TNF和MAPK1，与心绞痛气虚血瘀证相关的通路有神经活性配体-受体通路、钙信号通路、癌症通路、cGMP-PKG信号通路和TNF信号通路等。Guo等[26]的研究发现，这TNF, TLR4, NFKB1和SERPINE1 4个基因可能是心绞痛气虚血瘀证发病的关键基因。以上研究与本研究的部分结果相一致，一方面反映了疾病模块的有效性，另一方面本研究为心绞痛气虚血瘀证的发病机制提供了更全面的理论依据。
本研究首次结合心绞痛疾病模块筛选出大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证的关键基因30个，根据中心性排名，前十位的基因有STAT3、TNF、EGFR、AKT1、ALB、EP300、INS、GAPDH、IL6和SRC，其中STAT3度值最大排名居首。将30个关键基因进行相关性分析发现，STAT3、JAK1、JAK2、JAK3、ALB和FGF2这6个基因与“病-证-药”联系最为紧密，表明这可能是大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证的核心基因。既往文献研究认为，JAK1、JAK3在类风湿关节炎、特应性皮炎、癌症等疾病中发挥作用[27-29]；ALB是血浆中含量最多的蛋白质，是评价体内营养水平和肝损害的重要指标[30-31]；FGF2是影响肝癌预后的独立危险因素[32-33]；而JAK2、STAT3参与多种心血管疾病病理生理反应[34-36]。Marton的研究认为STAT3是影响心血管疾病的重要因素[37]。STAT3是JAK2下游的调节蛋白，JAK2被激活后使STAT3磷酸化，进一步激活心肌细胞中血管紧张素原基因启动子，血管紧张素原促进血管紧张素Ⅱ的生成，血管紧张素Ⅱ继续诱导IL-6家族成员cardiotrophin-1的合成，最终导致心肌细胞损伤[38]。另有研究从细胞凋亡角度阐释，JAK2/STAT3通路活化后，引发特定靶基因的表达增加，参与炎症、内皮细胞分化、血管生成，最终加速细胞凋亡[39]，导致心肌细胞缺血缺氧。有动物实验研究表明，通过调控JAK2/STAT3信号通路，抑制炎症反应和氧化应激，可以改善大鼠缺血性心律失常，增强心脏功能[40]。本研究基因功能富集分析得到82条相关通路，根据P值排名，前五条通路中都出现了STAT3，JAK2也表达活跃，表明JAK2、STAT3通过多通路参与了大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证的过程。
结合以上研究结果，我们认为JAK2/STAT3通路是大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证的最关键通路。为了验证这一推测，本研究继续进行了细胞实验。缺氧心肌细胞中加入大株红景天注射液后，JAK2和STAT3的蛋白表达水平显著降低，提示大株红景天注射液通过调节JAK2/STAT3通路保护了心肌细胞完整性，起到了改善心绞痛的作用。此外，细胞实验的结果也为本研究中心绞痛疾病模块的构建提供了有力的验证，在疾病模块中，STAT3作为新增基因中排序靠前的基因，显示了其与疾病模块中现有基因的较强关联，作为算法预测的结果，能够与细胞实验的结果有较好的呼应，这也显示出本研究结合疾病模块进行疾病机制发现的有效性。
我们通过基因功能及富集分析还揭示了与大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证相关的其他相关通路，包括肿瘤通路、HIF信号通路、EGFR酪氨酸激酶通路、PI3K-Akt信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、VEGF信号通路等，对这些通路的实验验证还有待进一步的研究。
4. 结论
在本研究中，我们采用网络药理学结合疾病模块的方法和实验验证探讨了大株红景天注射液治疗心绞痛气虚血瘀证的作用机制。通过网络拓扑分析，得到心绞痛气虚血瘀证的核心基因包括STAT3、EGFR、TP53和AKT1。我们证实大株红景天注射液通过降低JAK2/STAT3信号通路显著改善缺氧H9C2心肌细胞状态。这些发现为大株红景天注射液治疗冠心病心绞痛气虚血瘀证的病理机制提供了理论依据，验证了疾病模块方法的可靠性。
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图 2 冠心病心绞痛疾病模块
注：图中浅蓝色节点表示冠心病心绞痛的已有基因(种子基因)，紫色节点表示经过DIAMOnD算法预测得到的新增基因。图中节点的大小代表了节点的度值。
Figure 2. Disease module of coronary heart disease angina pectoris
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图 3 “心绞痛-气虚血瘀证”分子网络可视化
Figure 3. Visualization of molecular network of "angina pectoris-Qi deficiency and blood stasis syndrome"
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图 4 “病-证-药”分子网络可视化
Figure 4. Visualization of molecular network of "disease-syndrome-drug"
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图 5 “病-证-药”基因功能富集分析
注：a.“病-证-药”的核心基因可视化网络图，其中紫色基因表示核心基因与现有疾病基因重叠的基因，粉色基因表示与新增疾病基因重叠的基因；b.基因富集分析通路表；c.基因富集分析通路气泡图；d.GO-BP富集分析的气泡图。
Figure 5. Gene function enrichment analysis of "disease-syndrome-drug"
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图 6 造模时间选择、大株红景天注射液最佳浓度选择与尼可地尔最佳浓度的选择
注：与正常组比较，**P < 0.01；与模型组比较，##P＜0.01。
Figure 6. Selection of modeling time, selection of optimal concentration of Sofren Injection and selection of optimal concentration of Nicorandil
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图 7 各组缺氧心肌细胞中JAK2、STAT3mRNA的表达情况
注：与模型组比较，**P < 0.01。
Figure 7. Expression of JAK2 and STAT3 mRNA in hypoxic myocardial cells of each group
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图 8 各组蛋白表达情况
注：a.各组缺氧心肌细胞中JAK2、STAT3蛋白表达比较；b.不同组细胞中JAK2蛋白的表达情况；c.不同组细胞中STAT3蛋白的表达情况。与模型组比较，**P < 0.01。
Figure 8. Protein expression of each group
表 1 荧光定量PCR的引物
Table 1 Primers of fluorescence quantitative PCR
引物名称 序列 退火温度/℃ JAK2 F: CTGGCTGTCTATAACTCCATCAG 60 JAK2 R: CCTGCGGAATCTGTACCTTATC Stat3 F: ACCCAGATCCAGTCTGTAGAA 60 Stat3 R: GGAATGTCAGGGTAGAGGTAGA β-actin F: ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT 60 β-actin R: CCAGAGGCATACAGGGACAA 
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表 2 气虚血瘀证主要症状基因数目统计
Table 2 Statistics of the number of genes of Qi deficiency and blood stasis syndrome main symptoms
症状 基因计数 乏力 537 喘憋 2 106 心悸 70 气短 222 胸痛 167 血瘀 10
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表 3 DIAMOnD算法新筛选出的前20位基因
Table 3 Top 20 genes newly selected by DIAMOnD algorithm
排序 基因名称 P值 排序 基因名称 P值 1 ALB 3.47E-54 11 CCL4 5.21E-40 2 CD4 1.34E-45 12 CD8A 3.39E-39 3 STAT3 1.03E-42 13 IL15 2.09E-39 4 FN1 3.75E-41 14 IL9 1.66E-39 5 IL13 2.99E-40 15 ITGAX 2.06E-38 6 CXCL1 2.66E-41 16 CCL4L1 9.25E-36 7 CSF2 2.46E-41 17 CCR5 1.45E-35 8 VCAM1 2.61E-40 18 CD86 1.08E-36 9 PTPRC 1.48E-41 19 CTLA4 1.93E-36 10 CSF3 6.02E-39 20 CD40 6.67E-38
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表 4 冠心病心绞痛疾病模块基因拓扑属性(根据度值降序前20名)
Table 4 Gene topological attributes of disease module of coronary heart disease angina pectoris (top 20 in descending order of degree value)
基因名称 标签 度值 ASPL BC CC NC IL6 种子基因 137 1.538 5 0.068 0 0.650 0 43.956 2 TNF 种子基因 122 1.593 4 0.058 1 0.627 6 45.836 1 IL10 种子基因 120 1.644 7 0.031 3 0.608 0 47.416 7 STAT3 预测基因 108 1.681 3 0.047 6 0.594 8 46.398 1 IL1B 种子基因 105 1.685 0 0.031 0 0.593 5 48.476 2 CD4 预测基因 102 1.728 9 0.043 9 0.578 4 48.313 7 IL4 种子基因 98 1.765 6 0.015 3 0.566 4 51.081 6 CXCL8 种子基因 90 1.780 2 0.021 5 0.561 7 52.366 7 CCL2 种子基因 90 1.765 6 0.025 2 0.566 4 52.244 4 IFNG 种子基因 85 1.805 9 0.009 6 0.553 8 53.670 6 IL2 种子基因 84 1.805 9 0.010 7 0.553 8 53.690 5 CSF2 预测基因 82 1.860 8 0.007 4 0.537 4 54.939 0 CXCL10 种子基因 81 1.912 1 0.008 5 0.523 0 54.172 8 IL17A 种子基因 81 1.838 8 0.010 1 0.543 8 53.246 9 CCL5 种子基因 77 1.897 4 0.008 5 0.527 0 55.922 1 IL13 预测基因 77 1.882 8 0.014 0 0.531 1 51.987 0 CCL3 种子基因 72 1.959 7 0.007 5 0.510 3 56.611 1 CCL4 预测基因 71 1.948 7 0.007 1 0.513 2 57.070 4 ITGAM 种子基因 70 1.890 1 0.022 1 0.529 1 50.728 6 CXCR4 种子基因 67 1.882 8 0.021 6 0.531 1 46.358 2
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