Mechanism of Fangji Huangqi Tang against Nephrotic Syndrome Based on Network Pharmacology and Transcriptomics Methods
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摘要:目的 基于转录组学与网络药理学方法探讨防己黄芪汤治疗肾病综合征的作用机制。方法 收集网络药理学和转录组学的共同靶点, 进行GO/KEGG功能富集分析。构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)并进行网络拓扑分析, 确定潜在核心靶点。构建通路-靶点网络图, 确定发挥关键作用的信号通路。采用qPCR、Western blot法和免疫荧光染色验证大鼠肾脏组织中核心靶点的mRNA和蛋白表达水平。结果 PPI分析得到7个潜在核心靶点AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1和TLR4, 主要信号通路为AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、NF-κB信号通路、TGF-β信号通路、P53信号通路、MAPK信号通路、JAK-STAT信号通路和FoxO信号通路。经动物体内实验验证, 防己黄芪汤显著下调AKT1、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4的mRNA和蛋白表达水平(P < 0.05), 上调AMPK的mRNA和蛋白表达水平(P < 0.05)。结论 从网络药理学和转录组学角度初步阐明了防己黄芪汤治疗肾病综合征多成分、多靶点、多途径的整体调节特点, 可为后续的药理学研究和临床应用提供依据与参考。Abstract:OBJECTIVE To explore the mechanism of Fangji Huangqi Tang (FHT) in the treatment of nephrotic syndrome (NS) based on transcriptomics and network pharmacology.METHODS Intersection target genes of network pharmacology and transcriptomics were collected for GO/KEGG functional enrichment analysis. Protein-protein interactions (PPI) were constructed and network topology analysis was performed to identify potential core targets. The pathway-target network map was constructed to identify the key signaling pathways. Finally, real-time quantitative PCR (qPCR), western blot and immunofluorescence staining were used to verify the mRNA and protein expression levels of core targets in kidney tissues of rats.RESULTS Seven potential core targets AKT1, AMPK, CPT1B, NF-κB1, P53, TGF-β1 and TLR4 were identified by PPI analysis. The main signaling pathways were AMPK, PI3K-Akt, PPAR, NF-κB, TGF-β, P53, MAPK, JAK-STAT and FoxO. In animal experiments, FHT significantly down-regulated the mRNA and protein expression levels of AKT1, CPT1B, NF-κB1, P53, TGF-β1, TLR4 (P < 0.05), and up-regulated the mRNA and protein expression levels of AMPK (P < 0.05).CONCLUSION From the perspective of network pharmacology and transcriptomics, the overall regulation features of multi-component, multi-target and multi-pathway of FHT against NS were preliminaries elaborated, which could provide the basis and reference for subsequent pharmacological research and clinical application of FHT.
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Keywords:
- Fangji Huangqi Tang /
- nephrotic syndrome /
- transcriptomics /
- network pharmacology /
- mechanism
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肾病综合征是一组肾小球疾病的临床综合征, 主要表现为大量蛋白尿、水肿、高脂血症、低蛋白血症等。由于大量蛋白质通过尿液流失, 患者体内蛋白质的含量下降, 容易引起血浆胶体渗透压的降低[1]。早期诊断和治疗可有效延缓肾病综合征进展。目前, 免疫抑制剂和糖皮质激素类药物是治疗轻早期和中期肾病综合征的临床常用药物, 但这些药物仅针对症状, 无法根本改善肾病综合征病理状况, 常伴有感染、器官衰竭等不良反应, 且复发率高[2-3]。
防己黄芪汤出自《金匮要略》, 全方包括粉防己(Stephaniae Tetrandrae Radix)、黄芪(Astragali Radix)、白术(Atractylodis Macrocephalae Rhizoma)和甘草(Glycyrrhizae Radix et Rhizoma), 具有益气利水, 健脾祛湿之功效, 临床常用于治疗肾病综合征、风湿性关节炎、心脏性水肿等[4]。由于中药复方化学成分复杂, 常通过多环节、多靶点联合发挥药效, 故防己黄芪汤治疗肾病综合征的起效机制尚不够明确。近年来, 网络药理学联合转录组学的研究策略, 因兼具宏观性和微观性的显著特点而被认为是探索中药作用机制的合适方法[5-8]。本文采用网络药理学对防己黄芪汤治疗肾病综合征的分子网络机制进行分析, 应用转录组学对大鼠肾脏组织的RNA样本进行测序及生信分析, 同时使用分子生物学技术对前期筛选出关键分子的表达量进行考察与验证, 以期发现防己黄芪汤治疗肾病综合征的作用机制。
1. 材料
1.1 试药与仪器
饮片购自安徽铜陵禾田中药饮片有限公司: 粉防己饮片原产甘肃(批号: 20210628), 黄芪饮片原产甘肃(批号: 20210406), 白术饮片原产安徽(批号: 20210618), 甘草饮片原产新疆(批号: 20210726), 经南京中医药大学陈建伟教授鉴定均为正品, 各项检查均符合《中国药典》2020年版要求。
盐酸阿霉素购于大连美仑生物技术有限公司(货号: 20210814);BCA试剂盒(货号: 20210422), 尿素氮(BUN)试剂盒(货号: 20210512), 胆固醇(TC)试剂盒(货号: 20210321), 甘油三酯(TG)试剂盒(货号: 20210326), 半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(Cys-C)试剂盒(货号: 20210402)于南京建成生物研究所购买。超纯RNA提取试剂盒购于北京康为世纪生物科技有限公司(货号: 62387);AKT1抗体(货号: AF01510), p-AKT1抗体(货号: 3033S)、AMPK抗体(货号: AF300361)、p-AMPK抗体(货号: AF00447)、CPT1B抗体(货号: AF300562)、NF-κB1抗体(货号: AF02889)、P53抗体(货号: AF05780)、TGF-β1抗体(货号: AF03634)、TLR4抗体(货号: AF02459)均购于湖南艾方生物科技有限公司。β-actin抗体(货号: 102419210608)购于上海碧云天生物技术有限公司。
BP211D电子天平(德国Sartorius公司); 高速离心机(美国Thermo公司); 组织研磨仪(上海净信实业发展有限公司, 型号: Tiss-24);多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司, 型号: Speclra Max j3X); 涡旋震荡器(美国Thermo公司); 电泳仪(中国BAYGENE公司); PCR仪(美国Thermo公司); 超微量紫外分光光度计(美国Thermo Fisher公司, 型号: NanoDrop OneC); 凝胶成像系统(美国UVP公司); 激光显微镜(美国Thermo公司)。
根据《金匮要略》记载, 按照以下流程制备防己黄芪汤样品: 将粉防己、黄芪、白术、甘草饮片按4∶5∶3∶2质量比混合, 10倍量纯水浸泡30 min, 大火至沸, 改中火20 min, 4层纱布过滤, 得药渣和8倍量水共煮, 20 min后用4层纱布滤过, 2次水煎液合并浓缩至浓度为1 g·mL-1[9]。
1.2 动物
浙江省杭州医学院生产SD大鼠, 雄性, 体质量160~200 g，动物许可证号：SCXK(浙)2019-0002, 置室温23~28 ℃, 相对湿度45%±5%环境, 自由饮水及摄食。实验操作获南京中医药大学实验动物伦理委员会批准(批准号: 202201A013)。
2. 方法
2.1 网络药理学分析
2.1.1 防己黄芪汤药效活性成分、靶点的获取
参考本课题组前期采用典型相关性分析方法探讨大鼠多次给予防己黄芪汤后化学成分和肾病药效之间的相关性的结果[10], 即: 根据不同时间点入血成分强度大小, 在各时间点强度均低于100的入血成分不予考虑, 选择29种入血原型成分并成功进行了谱效相关分析。基于此, 本次防己黄芪汤活性成分选取这29种原型成分, 并通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP, https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php), 根据ADME原则进一步筛选, 排除口服生物利用度(OB) < 30%和类药性(DL) < 0.18的成分, 确定防己黄芪汤的活性成分及其靶点信息。通过TCMSP数据库获取每个活性成分对应的靶点信息, 同时利用PubChem数据库获取各成分的简化分子线性输入规范并依次导入Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)靶点预测, 物种为“Homo sapiens”, Probability>0.5的靶点蛋白作为活性成分作用靶点。两者进行合并去重, UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将靶点转换成人源基因名。
2.1.2 肾病综合征疾病靶点获取
以“Adriamycin Nephropathy”和“Nephrotic Syndrome”为关键词检索DisGeNET(https://www.disgenet.org/)和GeneCards数据库(https://www.genecards.org), 其中GeneCards数据库所得靶点以相关性分数由高到低排序, 以分值>2倍中位数为筛选条件筛选靶点, 所得结果合并之后去除重复靶点。
2.1.3 构建中药活性成分-靶点相互作用网络
利用Cytoscape 3.9.1软件(https://cytoscape.org/)构建“中药活性成分-靶点”网络图。其中, 边代表各节点的相互作用, 节点代表中药活性成分和靶基因。节点度值和相连边的数量有关, 度值越大, 说明网络中与该节点相关的节点数量越多。
2.2 动物实验
2.2.1 造模、分组及给药
大鼠随机分为正常组、模型组和防己黄芪汤组, 每组10只, 适应1周, 体质量约300 g, 模型组与防己黄芪汤组大鼠于2周内分2次尾静脉注射阿霉素4 mg·kg-1复制阿霉素肾病综合征大鼠模型[11-12], 正常组注射同体积生理盐水。依据《金匮要略》所载原方剂量和处方临床用量, 根据人与大鼠等剂量换算公式折算大鼠给药剂量, 将防己黄芪汤煎剂浓缩至0.7 g·mL-1, 按照10 mL·kg-1给药体积灌胃, 折合生药量为7 g·kg-1。于第22天开始给药干预, 连续5周。空白组和模型组均灌胃等量生理盐水。各组大鼠于第0、5、12、17、22、23、24、25、36、44、49、54、57、58、59、60天眼眶静脉丛取血约0.5 mL, 并于第0、3、10、13、17、28、45、52天, 用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液。于实验第60天摘取两侧肾脏, 生理盐水清洗并吸干, 称质量, 置于液氮中备用。
2.2.2 血清生化指标测定与肾组织病理检查
24 h大鼠尿液蛋白、血清BUN经比色法测定, 血清Cys-C、TC和TG的含量均通过对应试剂盒测定。经4%多聚甲醛固定的大鼠肾脏组织, 经脱水、包埋、切片、脱蜡等步骤, 进行HE及Masson染色实验, 观察肾间质纤维化、间质浸润、小管萎缩、小管细胞空泡变性等现象。
2.3 转录组测序及数据分析
按照RNA提取试剂盒说明书对正常组、模型组和防己黄芪汤组大鼠的肾脏组织进行RNA的提取, 每组3只。将提取的RNA溶液委托杭州联川生物技术股份有限公司进行转录组学测序。以表达差异倍数|log2Fold Change|>1、显著性P < 0.05为DEGs筛选条件, 得到正常组vs.模型组、防己黄芪汤组vs.模型组的差异表达基因, 进一步取交集得到转录组测序的差异表达基因[13-17]。
2.4 GO功能及KEGG通路富集分析
将上述网络药理学和转录组学的靶点基因导入到Draw Venn Diagram网站(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中绘制韦恩图, 得到共同靶点。提交David数据库(https://david.ncifcrf.gov/)并利用Cytoscape 3.9.1可视化分析软件的Clue Go数据库插件进行基因本体(GO)功能富集分析, 包括生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组分(CC)3个水平; 其中京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析设置P < 0.01, 得到防己黄芪汤治疗肾病综合征相关的生物学功能和信号通路。
2.5 蛋白质相互作用网络构建及核心靶点筛选
网络药理学和转录组学的共同靶点导入STRING在线数据库(http://string-db.org/), 物种设置为“Homo sapiens”, 设定最低相互作用阈值为高置信度“high confidence=0.7”, 其余参数保持默认设置进行蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)分析, 将分析所得结果保存为tsv.格式导入Cytoscape 3.9.1软件中, 运用“Network Analysis”进行网络拓扑属性分析, 最后依据“节点度值”“中介中心性”和“接近中心性”明确潜在核心靶点, 3个参数均大于平均值的蛋白即为防己黄芪汤治疗肾病综合征的潜在核心靶点。最后, 利用Cytoscape 3.9.1绘制通路-核心靶点网络图并进行网络拓扑属性分析。
2.6 核心靶点基因表达验证
2.6.1 qPCR实验
Trizol一步法提取肾脏组织总RNA, 并按逆转录试剂盒说明书操作, 构成体积为20 μL的PCR反应体系, 反转录产物2 μL、SYBR Green Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL。mRNA定量检测用SYBR Green Real-time PCR Master Mix试剂盒, 用2-ΔΔCt方法计算各基因mRNA相对表达量。以GAPDH作为内参基因, 所有实验共进行3次。目的基因的引物序列见表 1。
表 1 目的基因的引物序列Table 1. Primer sequence of target genes基因 序列(5’-3’) 产物长
度/bpAKT F: GCTTCTACGGTGCGGAGATTGTGT
R: GTCCGTTATCTTGATGTGCCCGTC125 AMPK F: GACCTCGGTCAAGTGTCGATTC
R: AACGGGCTAAAGCAGTGATAAGA168 CPT1B F: ATGTAAGTGACTGGTGGGAAGA
R: TGGGATGCGTGTAGTGTTGAA260 NF-κB1 F: AGATGTGGTGGAGGACTTGCT
R: CCGTTGGGGTGGTTGATAA162 P53 F: AAGGAAATCCGTATGCTGAGTAT
R: GCACAAACACGAACCTCAAAG235 TGF-β1 F: CATTTGGAGCCTGGACACACA
R: GCTTGCGACCCACGTAGTAGAC136 TLR4 F: AAGACTATCATCAGTGTATCGGTGG
R: CGTTTCTCACCCAGTCCTCATT181 GAPDH F: CGTATCGGACGCCTGGTT
R: AGGTCAATGAAGGGGTCGTT83 2.6.2 Western blot实验
利用BCA试剂盒对肾脏总蛋白定量, SDS-PAGE电泳, 每孔30 μg蛋白量, 蛋白转印到PVDF膜上, 封闭2 h(5%脱脂奶粉溶液)。加入相应一抗AKT(1 ∶ 1 000), p-AKT(1 ∶ 1 000), AMPK(1 ∶ 1 000), p-AMPK(1 ∶ 1 000), CPT1B(1 ∶ 1 000), NF-κB1(1 ∶ 1 000), P53(1 ∶ 1 000), TGF-β1(1 ∶ 1 000), TLR4(1 ∶ 1 000), β-actin(1 ∶ 3 000), 孵育过夜, TBST洗膜4次, 后加入IgG-HRP(1 ∶ 1 000 0)孵育2 h; TBST洗膜4次后显影并采集图像, 分度值分析, 计算各个蛋白条带的相对表达水平。化学发光法检测蛋白条带, 以β-actin作为蛋白载量对照, 所有实验共进行3次。
2.6.3 免疫荧光染色实验
组织切片脱蜡, 于柠檬酸盐-EDTA抗原修复液中微波炉加热修复, 5%的牛血清白蛋白封闭15 min, AKT(1 ∶ 1 000), p-AKT(1 ∶ 1 000), AMPK(1 ∶ 1 000), p-AMPK(1 ∶ 1 000), CPT1B(1 ∶ 1 000), NF-κB1(1 ∶ 1 000), P53(1 ∶ 1 000), TGF-β1(1 ∶ 1 000), TLR4(1 ∶ 1 000), β-actin(1 ∶ 3 000)抗体4 ℃孵育过夜; 次日, 荧光二抗于室温下孵育1 h, 封片用含有DAPI的抗荧光淬灭剂, 激光共聚焦显微镜下观察。
2.7 统计学方法
使用GraphPad Prism 8.03软件, 组间比较采用单因素方差分析, 以x±s表示统计结果, 组间的两两比较采用t检验, P < 0.05为差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1 防己黄芪汤药效活性成分及靶点的获取
各中药药效活性成分为粉防己8个、黄芪7个、白术3个和甘草11个, 共29种, 口服生物利用度和类药性均较高, 基本信息见表 2。通过检索, 29种活性成分通过Swiss Target Prediction数据库查找潜在关联靶点463个, 由GeneCards、DisGeNET数据库检索得肾病综合征相关靶点635个, 将中药活性成分靶点和疾病靶点取交集, 去重, 获得247个共同靶点, 即网络药理学预测防己黄芪汤治疗肾病综合征的关键靶点。利用Cytoscape 3.9.1构建中药活性成分-靶点网络(图 1)。
表 2 防己黄芪汤活性成分基本信息Table 2. Basic information of active ingredients of Fangji Huangqi Tang序号 成分名称 口服生物利用度(OB)/% 类药性(DL) 归属药物 1 Calycosin-7-O-D-glucoside 36.52 0.23 防己 2 Corydine 37.16 0.55 防己 3 Isoliguiritigenin 33.64 0.26 防己 4 Fangchinoline 41.73 0.21 防己 5 (-)-Tetrahydropalmatine 73.94 0.64 防己 6 (+)-Tetrandrine 36.64 0.20 防己 7 Liquiritigenin 32.76 0.18 防己 8 Isoliquiritin 38.61 0.60 防己 9 Glycycoumarin 43.56 0.44 黄芪 10 Atractylenolide Ⅲ 35.95 0.21 黄芪 11 Atractylenolide Ⅰ 37.37 0.19 黄芪 12 Isolicoflavonol 45.17 0.42 黄芪 13 Licoricone 63.58 0.47 黄芪 14 Atractylenolide Ⅱ 52.36 0.19 黄芪 15 Licoricidin 30.99 0.62 黄芪 16 (+)-Cassythicine 32.64 0.20 白术 17 Nantenine 35.49 0.74 白术 18 Cyclanoline 42.64 0.57 白术 19 Liquiritin 39.20 0.52 甘草 20 Astragaloside Ⅳ 41.78 0.63 甘草 21 Licochalcone B 76.76 0.19 甘草 22 Methylnissolin 3-O-glucoside 36.22 0.18 甘草 23 Calycosin 45.75 0.24 甘草 24 Fenfangjine F 43.30 0.23 甘草 25 Astragaloside Ⅶ 30.94 0.45 甘草 26 Formononetin 69.67 0.22 甘草 27 Vestitol 74.66 0.24 甘草 28 Glycyrrhizin 39.62 0.21 甘草 29 Astragaloside Ⅱ 46.06 0.23 甘草 ![]()
图 1 中药活性成分-靶点网络Figure 1. Active ingredient-target network of traditional Chinese medicine3.2 大鼠肾病综合征相关指标评价
如图 2所示, 模型组和防己黄芪汤组第17天大鼠24 h尿蛋白含量大于100 mg, 说明阿霉素肾病大鼠模型复制成功。自第22天给药防己黄芪汤后, 于实验第28、45、52天可观察到, 相对于正常组, 模型组大鼠的24 h尿蛋白含量呈现显著升高的趋势(P < 0.001);相对于模型组, 防己黄芪汤组大鼠的24 h尿蛋白含量呈现显著降低的趋势(P < 0.001)。给药后(实验第23、24、25、36、44、49、54、57、58、59、60天), 相对于正常组, 模型组大鼠血清中BUN、TC、TG和Cys-C水平有显著升高的趋势(P < 0.001);相对于模型组, 防己黄芪汤组大鼠血清中BUN、TC、TG和Cys-C水平有显著降低的趋势(P < 0.001)。实验结束时(第60天), 相对于正常组, 模型组大鼠的肾脏指数显著升高(P < 0.001);相对于模型组, 防己黄芪汤组大鼠的肾脏指数显著降低(P < 0.001)。
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图 2 防己黄芪汤对各组小鼠肾病综合征相关指标的影响注; 与正常组比较, * * *P < 0.001;与模型组比较, ##P < 0.01, ###P < 0.001。x±s, n=10。Figure 2. Effects of Fangji Huangqi Tang on indexes related to nephrotic syndrome3.3 大鼠肾皮质HE和Masson染色
HE染色显示: 正常组结构排列整齐, 结构正常, 模型组肾脏病变明显, 部分肾小球基底膜增厚和上皮细胞肿胀, 防己黄芪汤干预后病理有一定的改善。Masson染色显示: 正常组存在较少蓝色的胶原纤维, 模型组中存在较多胶原纤维, 说明阿霉素造模促使肾组织发生明显的肾纤维化, 防己黄芪汤组干预后胶原纤维较模型组变少, 肾脏损伤情况有所改善(图 3)。
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图 3 防己黄芪汤对各组大鼠肾脏组织的病理学影响(HE, ×200;Masson, ×200)Figure 3. Effects of Fangji Huangqi Tang on histopathological morphology of kidneys in all groups (HE, ×200; Masson, ×200)3.4 转录组测序的差异表达基因
转录组测序显示正常组vs.模型组筛选后共得到2 090个差异表达基因(上调1 441个, 下调949个)。防己黄芪汤组vs.模型组筛选后共得到1 877个差异表达基因(上调694个, 下调1 183个)(图 4)。将正常组vs.模型组筛选到的2 090个差异表达基因和防己黄芪汤组vs.模型组筛选得到的1 877个差异表达基因进一步取交集, 得到323个共同差异表达基因。差异表达基因的热图分析显示, 与正常组比较, 模型组肾脏组织内上调基因243个, 下调基因80个。给药防己黄芪汤后, 造模大鼠肾脏差异基因的表达量向正常组显著回调(图 5)。
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图 4 正常组vs.模型组、防己黄芪汤组vs.模型组差异基因表达的火山图Figure 4. Volcano diagram of differential expression gene of control group vs. model group and Fangji Huangqi Tang group vs. model group![]()
图 5 转录组学差异基因表达热图Figure 5. Heat map of differential expression genes by transcriptomics3.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
将转录组测序的323个差异表达基因(DEGs)与网络药理学的247个靶点取交集, 共获得79个共同靶点(图 6)。为了研究防己黄芪汤干预后差异表达的mRNA的生物学功能, 对这79个共同靶点进行GO功能富集分析, 以P < 0.05为条件共筛选得到523个显著富集条目, 其中BP分析236个、CC分析121个、MF分析166个。根据所得条目的显著性P值由小到大进行排列, 对BP、CC、MF中前10位的条目绘制条形图(图 7)。图中纵坐标代表具体的条目, 横坐标代表富集在条目的基因个数。GO功能富集分析中排名较前的条目主要有: ①BP分析: 炎症应答(Inflammatory response)、对药物的反应(Response to drug)、蛋白质磷酸化(Protein phosphorylation)、细胞增殖的正向调节(Positive regulation of cell proliferation)、基因表达的正向调节(Positive regulation of gene expression)等; ②CC分析: 细胞质(Cytoplasm)、细胞外区域(Extracellular region)、细胞外空间(Extracellular space)、薄膜(Membrane)、细胞外来体(Extracellular exosome)等; ③MF分析: 相同蛋白结合(Identical protein binding)、ATP结合(ATP binding)、蛋白质丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性(Protein serine/threonine/tyrosine kinase activity)、受体结合(Receptor binding)、蛋白激酶结合(Protein kinase binding)等。KEGG通路富集分析结果显示79个共同靶点显著富集在61条通路上, 选取P < 0.01的前40条通路, 绘制气泡图, 见图 7。图中气泡大小表示富集靶点数量, 颜色代表P值大小, 颜色越红则显著性越大。KEGG通路富集结果提示, 防己黄芪汤治疗肾病综合征的过程与AMPK信号通路(AMPK signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、PPAR信号通路(PPAR signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-κB signaling pathway)、TGF-β信号通路(TGF-β signaling pathway)、P53信号通路(P53 signaling pathway)、MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)、Jak-STAT信号通路(Jak-STAT signaling pathway)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)等密切相关。
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图 6 网路药理学和转录组学交集靶点基因的韦恩图Figure 6. Venn diagram of intersection target genes of network pharmacology and transcriptomics![]()
图 7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析Figure 7. GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis3.6 PPI网络的构建和核心靶点的筛选
首先把79个共有靶点导入STRING在线数据库, 以获取PPI网络图(图 8), 图中有79个节点, 703条边(其中5个靶点不连接其他蛋白, 故不显示)。将此结果以tsv.格式下载并导入Cytoscape 3.9.1软件进行核心蛋白分析, 得该PPI网络的平均节点度值为18.02, 平均中介中心性为0.052 3, 平均接近中心性为0.413 2, 平均拓扑系数为0.234 6。以“节点度值”“中介中心性”和“接近中心性”3个主要参数筛选关键基因, 筛选阈值为节点度值≥ 18.02, 接近中心性≥ 0.413 2, 中介中心性≥0.052 3, 筛选后得7个潜在核心靶点, 分别为AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1和TLR4, 各项参数见表 3。
表 3 潜在核心靶点在蛋白互作网络中的参数Table 3. Parameters of potential core targets in protein-protein interaction (PPI)基因名称 度值 接近中心性 中介中心性 拓扑系数 AKT1 57 0.793 8 0.154 3 0.261 8 AMPK 56 0.763 2 0.132 5 0.300 5 P53 52 0.725 4 0.113 6 0.313 0 TLR4 41 0.623 8 0.096 5 0.380 4 CPT1B 32 0.526 9 0.075 3 0.443 3 NF-κB1 30 0.503 2 0.072 1 0.435 8 TGF-β1 26 0.472 5 0.063 8 0.506 7 查阅文献后利用“3.5”项下与本次研究方向较为相关的KEGG富集通路和7个核心靶点绘制通路-靶点网络图(图 9)。图中涉及16个节点, 21条边, 蓝色长方形代表靶点, 橙色三角形代表通路, 靶点与通路之间代表该靶点位于对应连线的通路上; 图中与靶点相连的直线越多, 代表该靶点涉及的通路越多, 在通路-靶点网络图中越重要。7个核心靶点AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4与AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、NF-κB信号通路、TGF-β信号通路、P53信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和FoxO信号通路密切相关, 提示这9条信号通路和7个核心靶点在防己黄芪汤治疗肾病综合征中发挥关键作用。
3.7 核心靶点基因的实验验证
qPCR结果显示, 与正常组比较, 模型组AKT1、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4 mRNA表达升高(P < 0.001), AMPK mRNA表达降低(P < 0.001);与模型组比较, 防己黄芪汤组AKT1、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4 mRNA表达降低(P < 0.01), AMPK mRNA表达升高(P < 0.001)(图 10)。表明这7个核心靶点基因的相对定量值与转录组测序数据趋势一致, 证明转录组学的结果可靠且重复性好。Western blot分析结果显示, 与正常组比较, 模型组AKT1、p-AKT1、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4蛋白表达升高(P < 0.05), AMPK和p-AMPK蛋白表达降低(P < 0.01);与模型组比较, 防己黄芪汤组AKT1、p-AKT1、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4蛋白表达降低(P < 0.05), AMPK和p-AMPK蛋白表达升高(P < 0.05)(图 11~12)。免疫荧光染色的趋势与Western blot、qPCR的结果保持一致。
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图 10 qPCR检测肾组织中AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4的mRNA表达注; 与正常组比较, * * *P < 0.001;与模型组比较, ##P < 0.01, ###P < 0.001。x±s, n=3。Figure 10. Expressions of AKT1, AMPK, CPT1B, NF-κB1, P53, TGF-β1 and TLR4 mRNA in kidney tissues by qPCR![]()
图 11 Western blot检测肾组织中AKT1、p-AKT1、AMPK、p-AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4的蛋白表达注; 与正常组比较, *P < 0.05, * *P < 0.01, * * *P < 0.001;与模型组比较, #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001。x±s, n=3。Figure 11. Expressions of AKT1, p-AKT1, AMPK, p-AMPK, CPT1B, NF-κB1, P53, TGF-β1 and TLR4 protein in kidney tissues by Western blot![]()
图 12 免疫荧光染色法检测肾组织中AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4的蛋白表达(×200)Figure 12. Expressions of AKT1, AMPK, CPT1B, NF-κB1, P53, TGF-β1 and TLR4 protein in kidney tissues by immunofluorescence (×200)3.8 靶点通路分析图
着重选取“3.6”项下与本次研究密切相关的9条信号通路(AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、NF-κB信号通路、TGF-β信号通路、P53信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和FoxO信号通路)与经验证的7个核心靶点(AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1和TLR4), 利用KEGG Mapper网站(https://www.kegg.jp/kegg/mapper/)绘制防己黄芪汤抗肾病综合征作用的通路图(图 13)。图中潜在核心靶点标记为红色, 防己黄芪汤治疗肾病综合征的信号通路标记为绿色。图中提示防己黄芪汤治疗肾病综合征的靶点主要分散于这9条通路中, 通过调节核心靶点发挥作用。
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图 13 防己黄芪汤治疗肾病综合征的靶点通路分析图Figure 13. Target pathway analysis of Fangji Huangqi Tang against nephrotic syndrome4. 讨论
中医认为肾病综合征发病病机主要是正虚与邪实两个方面, 病机中心是风湿内扰于肾。现代临床在本虚标实的辨证思路下, 采用健脾益气、利水渗湿等治法。防己黄芪汤作为固表益气、祛风利湿的代表方剂, 防治肾病综合征的效果已在临床上得到验证。但中药复方作用的复杂性, 使其发挥作用的机制仍不明确。因此, 本研究基于网络药理学与转录组学, 在系统和分子水平综合分析防己黄芪汤中的药物活性成分对应靶点、肾病综合征疾病靶点、富集通路、生物过程对其治疗肾病综合征的作用机制, 并通过分子生物学技术对潜在核心靶点进行验证。
本次研究中, 利用生物信息学分析发现防己黄芪汤的治疗作用是通过7个核心靶点AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4来介导AMPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、PPAR信号通路、NF-κB信号通路、TGF-β信号通路、P53信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路和FoxO信号通路。AMPK是生物体内重要的蛋白激酶, 能够协调能量代谢, 激活AMPK可以降低炎性反应而阻止或延缓输尿管梗阻造成的肾脏纤维化进程, 也可抑制由NF-κB信号诱导的炎性反应。在肾脏纤维化的发病机制中, 炎性反应起着至关重要的作用[18-20]。Toll样受体4(TLR4)信号通路调控炎症应答反应, 肾受到损伤刺激时可被激活, 促进大量炎症因子和趋化因子的分泌、氧化应激、巨噬细胞表型的转化, 加快肾纤维化的疾病进展。急慢性肾纤维化发展过程中, 在TLR4活化的状态下, 下游NF-κB信号通路被激活, 导致炎症因子和趋化因子大量分泌[21-23]。激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路的作用为抑制细胞凋亡, 且活化后加入到NF-κB P65的磷酸化、核转位过程中, 促使炎症反应的加重。PI3K/Akt信号通路的中心环节AKT是PI3K下游的重要的信号传导标志物和效应分子, 通过阻断Bcl2和Bad的结合, 进而抑制细胞凋亡[24-26]。TGF-β1能够降低组织蛋白水解酶mRNA的合成, 抑制细胞外基质降解, 使某些蛋白水解酶抑制剂的合成增加, 细胞外基质集聚, 导致肾小球硬化[27-31]。肉毒碱棕榈酰基转移酶1B(CPT1B)调控脂质代谢, 是β-氧化的底物, 能够使线粒体肉毒碱含量增加, 是诊断和预测肾病综合征疾病进程的重要标志物[32]。P53蛋白是重要的细胞周期、凋亡调节蛋白, 参与调控肾小管上皮细胞衰老、肾小球系膜细胞增殖和凋亡及肾脏纤维化中[33-35]。上述7个核心靶点经实验验证, 防己黄芪汤能降低AKT1、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4的mRNA和蛋白表达(P < 0.05), 升高AMPK的mRNA和蛋白的表达(P < 0.05)。由此可见, 防己黄芪汤通过以上关键通路及靶点调节肾病综合征过程中的炎症、免疫、凋亡等来达到防治肾脏损伤的效果。
综上所述, 通过网络药理学与转录组学研究发现, 防己黄芪汤可能通过多成分、多靶点、多途径来协调发挥防治肾病综合征的作用, 可为后续防己黄芪汤抗肾病综合征的药理学研究和临床应用提供理论依据与参考线索。
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图 1 中药活性成分-靶点网络
Figure 1. Active ingredient-target network of traditional Chinese medicine
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图 2 防己黄芪汤对各组小鼠肾病综合征相关指标的影响
注; 与正常组比较, * * *P < 0.001;与模型组比较, ##P < 0.01, ###P < 0.001。x±s, n=10。
Figure 2. Effects of Fangji Huangqi Tang on indexes related to nephrotic syndrome
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图 3 防己黄芪汤对各组大鼠肾脏组织的病理学影响(HE, ×200;Masson, ×200)
Figure 3. Effects of Fangji Huangqi Tang on histopathological morphology of kidneys in all groups (HE, ×200; Masson, ×200)
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图 4 正常组vs.模型组、防己黄芪汤组vs.模型组差异基因表达的火山图
Figure 4. Volcano diagram of differential expression gene of control group vs. model group and Fangji Huangqi Tang group vs. model group
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图 5 转录组学差异基因表达热图
Figure 5. Heat map of differential expression genes by transcriptomics
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图 6 网路药理学和转录组学交集靶点基因的韦恩图
Figure 6. Venn diagram of intersection target genes of network pharmacology and transcriptomics
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图 7 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析
Figure 7. GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis
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图 10 qPCR检测肾组织中AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4的mRNA表达
注; 与正常组比较, * * *P < 0.001;与模型组比较, ##P < 0.01, ###P < 0.001。x±s, n=3。
Figure 10. Expressions of AKT1, AMPK, CPT1B, NF-κB1, P53, TGF-β1 and TLR4 mRNA in kidney tissues by qPCR
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图 11 Western blot检测肾组织中AKT1、p-AKT1、AMPK、p-AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4的蛋白表达
注; 与正常组比较, *P < 0.05, * *P < 0.01, * * *P < 0.001;与模型组比较, #P < 0.05, ##P < 0.01, ###P < 0.001。x±s, n=3。
Figure 11. Expressions of AKT1, p-AKT1, AMPK, p-AMPK, CPT1B, NF-κB1, P53, TGF-β1 and TLR4 protein in kidney tissues by Western blot
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图 12 免疫荧光染色法检测肾组织中AKT1、AMPK、CPT1B、NF-κB1、P53、TGF-β1、TLR4的蛋白表达(×200)
Figure 12. Expressions of AKT1, AMPK, CPT1B, NF-κB1, P53, TGF-β1 and TLR4 protein in kidney tissues by immunofluorescence (×200)
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图 13 防己黄芪汤治疗肾病综合征的靶点通路分析图
Figure 13. Target pathway analysis of Fangji Huangqi Tang against nephrotic syndrome
表 1 目的基因的引物序列
Table 1 Primer sequence of target genes
基因 序列(5’-3’) 产物长
度/bpAKT F: GCTTCTACGGTGCGGAGATTGTGT
R: GTCCGTTATCTTGATGTGCCCGTC125 AMPK F: GACCTCGGTCAAGTGTCGATTC
R: AACGGGCTAAAGCAGTGATAAGA168 CPT1B F: ATGTAAGTGACTGGTGGGAAGA
R: TGGGATGCGTGTAGTGTTGAA260 NF-κB1 F: AGATGTGGTGGAGGACTTGCT
R: CCGTTGGGGTGGTTGATAA162 P53 F: AAGGAAATCCGTATGCTGAGTAT
R: GCACAAACACGAACCTCAAAG235 TGF-β1 F: CATTTGGAGCCTGGACACACA
R: GCTTGCGACCCACGTAGTAGAC136 TLR4 F: AAGACTATCATCAGTGTATCGGTGG
R: CGTTTCTCACCCAGTCCTCATT181 GAPDH F: CGTATCGGACGCCTGGTT
R: AGGTCAATGAAGGGGTCGTT83 
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表 2 防己黄芪汤活性成分基本信息
Table 2 Basic information of active ingredients of Fangji Huangqi Tang
序号 成分名称 口服生物利用度(OB)/% 类药性(DL) 归属药物 1 Calycosin-7-O-D-glucoside 36.52 0.23 防己 2 Corydine 37.16 0.55 防己 3 Isoliguiritigenin 33.64 0.26 防己 4 Fangchinoline 41.73 0.21 防己 5 (-)-Tetrahydropalmatine 73.94 0.64 防己 6 (+)-Tetrandrine 36.64 0.20 防己 7 Liquiritigenin 32.76 0.18 防己 8 Isoliquiritin 38.61 0.60 防己 9 Glycycoumarin 43.56 0.44 黄芪 10 Atractylenolide Ⅲ 35.95 0.21 黄芪 11 Atractylenolide Ⅰ 37.37 0.19 黄芪 12 Isolicoflavonol 45.17 0.42 黄芪 13 Licoricone 63.58 0.47 黄芪 14 Atractylenolide Ⅱ 52.36 0.19 黄芪 15 Licoricidin 30.99 0.62 黄芪 16 (+)-Cassythicine 32.64 0.20 白术 17 Nantenine 35.49 0.74 白术 18 Cyclanoline 42.64 0.57 白术 19 Liquiritin 39.20 0.52 甘草 20 Astragaloside Ⅳ 41.78 0.63 甘草 21 Licochalcone B 76.76 0.19 甘草 22 Methylnissolin 3-O-glucoside 36.22 0.18 甘草 23 Calycosin 45.75 0.24 甘草 24 Fenfangjine F 43.30 0.23 甘草 25 Astragaloside Ⅶ 30.94 0.45 甘草 26 Formononetin 69.67 0.22 甘草 27 Vestitol 74.66 0.24 甘草 28 Glycyrrhizin 39.62 0.21 甘草 29 Astragaloside Ⅱ 46.06 0.23 甘草
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表 3 潜在核心靶点在蛋白互作网络中的参数
Table 3 Parameters of potential core targets in protein-protein interaction (PPI)
基因名称 度值 接近中心性 中介中心性 拓扑系数 AKT1 57 0.793 8 0.154 3 0.261 8 AMPK 56 0.763 2 0.132 5 0.300 5 P53 52 0.725 4 0.113 6 0.313 0 TLR4 41 0.623 8 0.096 5 0.380 4 CPT1B 32 0.526 9 0.075 3 0.443 3 NF-κB1 30 0.503 2 0.072 1 0.435 8 TGF-β1 26 0.472 5 0.063 8 0.506 7
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