Comparative Analysis of Multiple-Index Constituents in Roots and Rhizomes of Panax japonicus by UFLC-QTRAP-MS/MS
-
摘要:目的 建立超快速液相色谱-三重四级杆/线性离子阱质谱法(UFLC-QTRAP-MS/MS)同时测定竹节参根与根茎中皂苷、氨基酸及核苷类共33种成分含量的方法。方法 采用XBridge®C18(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm), 以0.1%甲酸水-0.1%甲酸乙腈为流动相, 梯度洗脱, 流速0.8 mL·min-1, 柱温30 ℃, 多反应监测离子扫描模式(MRM)测定。根据33种目标成分的含量, 采用聚类、非线性映射及主成分分析进行综合评价。结果 33种成分在一定浓度范围内均呈现良好的线性关系, 相关系数均大于0.999 0;精密度、重复性和稳定性良好; 平均加样回收率为96.90%~101.6%, RSD均≤3.6%。统计分析结果显示从33种成分的含量角度, 竹节参根与根茎中皂苷、氨基酸及核苷类成分较为相似。结论 所建立的方法准确、可靠, 可为竹节参药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考, 同时为竹节参根的开发利用提供基础资料。Abstract:OBJECTIVE To develop a method for the determination of saponins, amino acids and nucleosides in roots and rhizomes of Panax japonicus by UFLC-QTRAP-MS/MS.METHODS The extract was separated on a XBridge®C18(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm) at 30 ℃ with a gradient elution of 0.1% formic acid solution -0.1% formic acid acetonitrile, and the flow rate was 0.8 mL·min-1, using multiple-reaction monitoring (MRM) mode. Hierarchical cluster, nonlinear mapping and principal component analysis were adopted for comparison of roots and rhizomes.RESULTS 33 constituents showed good linearity (r>0.999 0) in the range of the tested concentration; the precision, repeatability and stability were good; the average recovery rates were between 96.90% and 101.6%, the relative standard deviations were less than or equal to 3.6%.CONCLUSION The results of data analysis showed that roots were similar to rhizomes according to contents of 33 constituents. The established method was accurate and reliable, which could used as a reference for quality evaluation and comprehensive control of Panax japonicus, and provided basic information for the development and utilization of roots of Panax japonicus.
-
Keywords:
- UFLC-QTRAP-MS/MS /
- Panax japonicus /
- root /
- rhizome /
- saponin /
- amino acid /
- nucleoside
-
竹节参始载于《百草镜》, 以其根状茎如竹节而得名, 历代本草著作中, 清赵学敏在《本草纲目拾遗》(1765年)昭参项下记有: “土人入山采根暴干, 色微黄, 形似白及, 长而有节者, 其味微甘而苦, 颇类人参。人参补气第一, 三七补血第一。叶同而功亦等, 故人并称曰人参三七, 为药品中之最珍贵者”[1]。竹节参具有散瘀止血, 消肿止痛, 祛痰止咳, 补虚强壮之功效, 用于治疗痨嗽咯血, 跌扑损伤, 咳嗽痰多, 病后虚弱等症[2]。现代研究表明, 竹节参主要含有皂苷、糖类、氨基酸和挥发油等化学成分[3]。其中皂苷类成分为主要药效成分, 具有抗氧化[4]、抗炎[5]、抗心肌缺血[6]等多种药理活性; 氨基酸类具有抗氧化[7]、调节免疫[8]、抗心肌缺血[9]等多种活性; 核苷类具有调节中枢神经系统[10]、抗炎[11]、抗血小板聚集[11]、镇静[11]、抗病毒[12]等多种活性。中药疗效的发挥是多种成分综合作用的结果, 针对竹节参多元活性成分的特点, 建立多元成分同时测定的方法, 对探讨多指标成分的综合评价体系具有实用性和有效性。
历版《中国药典》中规定, 竹节参以五加科植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的干燥根茎入药[3]。而竹节参地下部分中肉质根占比较大, 尤其是栽培品种。同时, 当前药材市场上流通的竹节参药材存在根部残留的现象。从外观性状上可明显区分两者, 根茎存在节与节间、芽, 而根无此特征。本实验从外观性状区分根与根茎, 对其主要化学成分含量进行比较分析, 为进一步明确竹节参药用部位提供一定科学依据。
目前, 关于竹节参药材的质量评价, 文献中多以一种或多种皂苷类成分为评价指标, 尚少见结合多类成分同时测定的报道; 其分析方法以高效液相色谱法(HPLC)[13-14]为主。本实验基于超快速液相色谱-三重四级杆/线性离子阱质谱(UFLC-QTRAP-MS/MS)技术, 建立同时测定竹节参根与根茎中14种皂苷、11种氨基酸及8种核苷类共33种成分含量的方法, 并用聚类、非线性映射及主成分分析对竹节参根与根茎样品中33种指标成分进行比较分析及综合评价, 以期为竹节参药材内在质量的综合评价和全面控制提供新的方法参考, 同时为竹节参根的开发利用提供基础资料。
1. 材料
1.1 仪器
SIL-20A XR超快速液相色谱仪, LC-20AD二元输液泵、STL-20A XR自动进样器和CTO-20AC柱温箱(日本Shimadzu公司); AB QTRAP 5500三重四极杆线性离子阱质谱仪, 电喷雾离子源, Analyst 1.6.3软件(美国AB SCIEX公司); Q-500B高速多功能粉碎机(上海冰都电器有限公司); ME36S型电子分析天平(1/100万, 德国赛多斯公司); BSA2245型电子分析天平(1/10万, 德国赛多利斯公司); DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司); KQ-500B超声波清洗机(昆山超声仪器有限公司, 超声功率500 W, 40 kHz); 湘仪H1650-W高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); Milli-Q超纯水制备仪(美国Millipore公司)。
1.2 试剂
对照品L-组氨酸(L-Histidine, 即L-His, 批号: O60M821V)、L-精氨酸(L-Arginine, 即L-Arg, 批号: S16A6G1)、L-丝氨酸(L-Serine, 即L-Ser, 批号: SM0503GC13)、L-丙氨酸(L-Alanine, 即L-Ala, 批号: 520A6G17672)、L-天冬氨酸(L-Aspartic acid, 即L-Asp, 批号: BCBG3906V)、L-苏氨酸(L-Threonine, 即L-Thr, 批号: S01F4G1)、L-脯氨酸(L-Proline, 即L-Pro, 批号: S30J6G1)、2'-脱氧胞苷(2'-Deoxycytidine, 即2’-Deoxycyt, 批号: N19S7W21266)、胞苷(Cytidine, 即Cyt, 批号: MM0316YA12)、尿苷(Uridine, 即Uri, 批号: TM0313XA13)、L-异亮氨酸(L-Isoleucine, 即L-Isoleu, 批号: SM0503GD13)、L-亮氨酸(L-Leucine, 即L-Leu, 批号: SLBB9163V)、腺苷(Adenosine, 即Ade, 批号: Z23S7J21814)、鸟苷(Guanosine, 即Gua, 批号: AJ0609NA14)、肌苷(Inosine, 即Ino, 批号: TJ0623XA13)、2'-脱氧鸟苷(2'-Deoxyguanosine, 即2'-Deoxygua, 批号: N07A7W12580)、L-苯丙氨酸(L-Phenylalanine, 即L-Phe, 批号: J04J7R8481)、胸苷(Thymidine, 即Thy, 批号: DN1122WB13)、三七皂苷R2(20S)[Notoginsenoside R2(20S), 即N-R2(20S), 批号: P20N6F6255], 纯度均大于98%, 均购自上海源叶生物技术有限公司; 三七皂苷R1(Notoginsenoside R1, 即N-R1, 批号: lw16080802)、人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1, 即G-Rg1, 批号: lw15121303)、人参皂苷Re(Ginsenoside Re, 即G-Re, 批号: lw16081605)、人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1, 即G-Rb1, 批号: lw16060402)、人参皂苷Rc(Ginsenoside Rc, 即G-Rc, 批号: lw15121701)、人参皂苷Rb2(Ginsenoside Rb2, 即G-Rb2, 批号: lw16061503)、伪人参皂苷F11(Pseudoginsenoside F11, 即P-F11, 批号: lw16081901)、人参皂苷Ro(Ginsenoside Ro, 即G-Ro, 批号: lw16050405)、人参皂苷Rg2(20S) [Ginsenoside Rg2(20S), 即G-Rg2(20S), 批号: lw15123004]、拟人参皂苷RT1(Pseudoginsenoside RT1, 即P-RT1, 批号: lw17033006)、竹节参皂苷Ⅳ(Chikusetsusaponin Ⅳ, 即C-Ⅳ, 批号: lw17030208)、人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd, 即G-Rd, 批号: lw16051604)、竹节参皂苷Ⅳa(Chikusetsusaponin Ⅳa, 即C-Ⅳa, 批号: lw16081901), 纯度均大于98%, 均购自南京良纬生物技术有限公司; L-蛋氨酸(L-Methionine, 即L-Met, 批号: SLBC7548V), 纯度大于98%, 购自宝鸡市辰光生物科技有限公司。甲醇、乙腈与甲酸为色谱纯, 德国默克公司产品; 甲醇(批号: 143135)为色谱纯, 购自江苏汉邦科技有限公司; 实验用水为Milli-Q超纯水。
1.3 样品
竹节参样品实地采集于国内主产区, 均经南京中医药大学刘训红教授鉴定为五加科植物竹节参Panax japonicus C.A.Mey.的根或根茎。样品信息见表 1。留样凭证存放于南京中医药大学中药鉴定实验室。
表 1 竹节参样品信息Table 1. Information of samples of Panax japonicus样品 产地 R1(根), RM1(根茎) 湖北恩施(栽培) R2(根), RM2(根茎) 湖北恩施(栽培) R3(根), RM3(根茎) 湖北恩施(栽培) R4(根), RM4(根茎) 湖北恩施(栽培) R5(根), RM5(根茎) 四川巴中(栽培) R6(根), RM6(根茎) 四川普洱(栽培) R7(根), RM7(根茎) 四川普洱(栽培) R8(根), RM8(根茎) 云南文山(栽培) R9(根), RM9(根茎) 湖北恩施(栽培) R10(根), RM10(根茎) 湖北恩施(栽培) R11(根), RM11(根茎) 江西遂川(野生) R12(根), RM12(根茎) 四川成都(野生) R13(根), RM13(根茎) 四川乐山(野生) 2. 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱XBridge®C18(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm); 流动相0.1%甲酸水(A)-0.1%甲酸乙腈(B), 梯度洗脱, 0~4 min, 2%B; 4~6 min, 2%~25% B; 6~8 min, 25% B; 8~8.5 min, 25%~40%B; 8.5~11 min, 40%B; 11~12 min, 40%~98%B; 12~12.5 min, 98%~2%B; 12.5~15.1 min, 2%B; 柱温30 ℃; 流速0.8 mL·min-1; 进样量2.0 μL。
2.2 质谱条件
离子化方式: 电喷雾离子源(ESI); 多反应监测离子扫描模式(MRM)检测; 气帘气(CUR)流速: 30 L·min-1; 雾化气(GS1)流速: 65 L·min-1; 辅助气(GS2)流速: 65 L·min-1; 离子化温度(TEM): 600 ℃; 喷雾电压(IS): 正离子模式下5 500 V, 负离子模式下-4 500 V。优化的质谱条件参数、33种成分的MRM图及竹节参根与根茎提取离子流图的叠加图分别见表 2、图 1~2。
表 2 优化的质谱条件参数Table 2. Optimized MS/MS parameters化合物 分子式 tR/min MRM参数 离子对m/z 碰撞电压/V 碰撞能量/eV 离子模式 L-His C6H9N3O2 1.15 156.080/110.030 100.00 16.00 ESI+ L-Arg C6H14N4O2 1.17 175.120/70.020 100.00 18.00 ESI+ L-Ser C3H7NO3 1.24 106.050/59.990 100.00 8.00 ESI+ L-Ala C3H7NO2 1.25 90.060/44.020 100.00 10.00 ESI+ L-Asp C4H7NO4 1.25 134.050/87.960 59.00 10.00 ESI+ L-Thr C4H9NO3 1.27 120.070/74.000 100.00 20.00 ESI+ L-Pro C5H9NO2 1.35 116.070/70.020 68.00 10.00 ESI+ 2'-Deoxycyt C9H13N3O4 1.45 228.200/112.053 76.00 13.00 ESI+ Cyt C9H13N3O5 1.85 244.090/112.000 61.00 10.00 ESI+ L-Met C5H11NO2S 2.02 150.060/104.030 91.00 10.00 ESI+ Uri C10H13N5O5 2.51 244.896/113.000 10.00 13.00 ESI+ L-Isoleu C6H13NO 3.01 132.100/86.050 100.00 10.00 ESI+ L-Leu C6H13NO2 3.31 132.100/86.050 100.00 10.00 ESI+ Ade C10H13N5O4 3.34 268.100/136.070 86.00 23.00 ESI+ Gua C10H13N5O5 3.89 284.300/152.000 62.00 15.00 ESI+ Ino C10H12N4O5 3.95 269.000/137.070 46.00 15.00 ESI+ 2'-Deoxygua C10H13N5O4 4.42 268.100/152.100 61.00 15.00 ESI+ L-Phe C9H11NO2 6.45 166.100/120.050 100.00 14.00 ESI+ Thy C10H14N2O5 6.59 243.100/127.070 61.00 13.00 ESI+ N-R1 C47H80O18 9.01 932.412/638.300 -225.00 -50.00 ESI- G-Rg1 C42H72O14 9.66 845.680/637.400 -20.00 -35.00 ESI- G-Re C48H82O18 9.68 991.700/799.400 -120.00 -45.00 ESI- G-Rb1 C54H92O23 10.50 1109.600/352.00 111.00 31.00 ESI+ G-Rc C53H90O22 10.70 1077.600/1077.600 -120.00 -60.00 ESI- G-Rb2 C53H90O22 10.80 1077.600/1077.600 -120.00 -60.00 ESI- P-F11 C42H72O14 10.90 845.400/653.400 -110.00 -50.00 ESI- G-Ro C48H76O19 11.00 955.585/793.400 -5.00 -60.00 ESI- N-R2(20S) C41H70O13 11.10 769.427/637.400 -25.00 -38.00 ESI- G-Rg2(20S) C42H72O13 11.30 829.600/637.400 -20.00 -40.00 ESI- P-RT1 C47H74O18 11.40 949.380/641.300 261.00 55.00 ESI+ C-Ⅳ C47H74O18 11.40 926.000/569.300 -15.00 -60.00 ESI- G-Rd C48H82O18 11.50 991.700/783.400 -120.00 -55.00 ESI- C-Ⅳa C42H66O14 11.90 793.530/631.200 -185.00 -58.00 ESI- 2.3 对照品溶液的制备
分别精密称取L-组氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-苏氨酸、L-脯氨酸、2'-脱氧胞苷、胞苷、L-蛋氨酸、尿苷、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、腺苷、鸟苷、肌苷、2’-脱氧鸟苷、L-苯丙氨酸、胸苷、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、伪人参皂苷F11、人参皂苷Ro、三七皂苷R2(20S)、人参皂苷Rg2(20S)、假人参皂苷RT1、竹节参皂苷Ⅳ、人参皂苷Rd、竹节参皂苷Ⅳa的对照品适量, 置5 mL容量瓶中, 加70%甲醇溶解制成1 022、926、992、1 218、1 087、812、587、1 084、1 017、525、1 004、650、1 040、568、757、877、749、1 061、1 103、1 106、1 000、1 050、1 000、948、980、926、1 020、972、1 004、1 062、956、996、934 μg·mL-1的对照品储备液, 0.22 μm微孔滤膜滤过, 置于4 ℃冰箱, 备用。分别取各对照品储备液适量, 分别加70%甲醇定容至5 mL制成对照品溶液, 并逐级稀释, 得到一系列不同浓度的对照品溶液, 供分析用。
2.4 供试品溶液的制备
取样品粉末0.5 g(过60目筛), 精密称定, 置于25 mL具塞锥形瓶中, 加入70%甲醇10 mL, 密闭, 称质量, 超声处理(功率500 W, 频率40 kHz)60 min, 放置冷却, 再次称质量, 用70%甲醇补足质量损失, 摇匀, 过滤, 以12 000 r·min-1离心10 min, 取上清液, 0.22 μm微孔滤膜滤过, 即得供试品溶液。
2.5 方法学考察
2.5.1 线性方程、检测限、定量限
精密吸取“2.4”项下一系列浓度的对照品标准溶液, 按“2.1”“2.2”项下实验条件进样分析, 以对照品的峰面积为纵坐标Y, 对照品浓度为横坐标X进行线性回归, 得到标准曲线、相关系数(r)和线性范围, 结果见表 3。结果显示各化合物在线性范围内显示良好的线性关系, r均大于0.999 0。以各化合物的信噪比(S/N)约为3计算检测限(LOD), 以信噪比(S/N)约为10计算定量限(LOQ), 结果显示33种成分的检测限范围为0.13~6.65 ng·mL-1, 定量限范围为0.39~19.95 ng·mL-1。
表 3 33种成分的回归方程、相关系数、检测限和定量限Table 3. Linear regression equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of 33 compounds化合物 标准曲线 r 线性范围/(ng·mL-1) LOD/(ng·mL-1) LOQ/(ng·mL-1) L-His Y=128X+1.74×103 0.999 6 4.5~900 0.27 0.81 L-Arg Y=44.2X+1.08×104 0.999 4 21~3.36×105 2.08 6.25 L-Ser Y=2.32X+2.54×103 0.999 1 1.4~5.6×104 0.33 0.99 L-Ala Y=2.57X+553 0.999 7 32.7~1.044×105 3.76 11.28 L-Asp Y=206X+1.44×104 0.999 7 8.5~1.36×104 1.07 3.22 L-Thr Y=5.39X+537 0.999 3 0.67~2.7×104 0.13 0.39 L-Pro Y=142X+1.14×105 0.999 6 12.8~2.56×105 3.39 10.16 2’-Deoxycyt Y=393X-946 0.999 7 1.5~300 0.25 0.75 Cyt Y=209X+274 0.999 7 0.85~6.78×103 0.25 0.75 L-Met Y=72X+697 0.999 2 0.75~2.4×103 0.15 0.45 Uri Y=1 740X-4.83×104 0.999 7 29.9~5.98×103 1.50 4.50 L-Isoleu Y=188X+2.27×104 0.999 4 2.33~1.862×104 0.23 0.69 L-Leu Y=79.5X+3.33×104 0.999 3 25.6~4.08×104 5.12 15.36 Ade Y=3 950X+4.11×104 0.999 6 1.56~1.248×104 0.17 0.51 Gua Y=359X+2.28×105 0.999 3 12.8~1.28×105 2.02 6.06 Ino Y=4 650X+1.12×105 0.999 7 12.4~4.97×103 2.48 7.44 2’-Deoxygua Y=3 950X-2.88×105 0.999 7 1.5~300 0.15 0.45 L-Phe Y=124X+891 0.999 4 0.65~2.58×104 0.13 0.39 Thy Y=178X-403 0.999 4 4.12~1.65×103 0.82 2.46 N-R1 Y=8.96X+222 0.999 6 12.7~1.014×104 2.54 7.62 G-Rg1 Y=54.2X+1.15×104 0.999 3 7.23~2.312×105 1.45 4.35 G-Re Y=3.85X+3.17×103 0.999 4 33.3~5.32×105 6.65 19.95 G-Rb1 Y=54.3X+3.95×103 0.999 9 12.5~1.002×105 2.51 7.53 G-Rc Y=27.5X-280 0.999 7 12.5~4.99×103 0.25 0.75 G-Rb2 Y=6.32X+234 0.999 8 3.7~7.4×103 1.11 3.33 P-F11 Y=140X+1.85×104 0.999 4 19.2~1.232×105 3.84 11.52 G-Ro Y=15.4X+2.34×104 0.999 1 61.2~2.44×105 4.90 14.70 N-R2(20S) Y=3.47X+1.1×103 0.999 5 6.78~2.71×104 1.36 4.08 G-Rg2(20S) Y=202X+4.26×103 0.999 1 3.35~1.072×105 0.67 2.01 P-RT1 Y=7.97X+1.29×104 0.999 1 31.2~1×106 6.24 18.72 C-Ⅳ Y=16.9X+1.17×103 1.000 0 110~4.4×105 6.13 18.40 G-Rd Y=15.6X+1.04×104 0.999 9 31.4~1.26×105 6.28 18.84 C-Ⅳa Y=64.2X+8.91×104 0.999 3 8.29~3.32×105 0.81 2.43 2.5.2 精密度试验、重复性试验、稳定性试验
取“2.3”项下对照品储备液适量, 加体积分数70%甲醇定容至10 mL制成某一浓度的混合对照品溶液, 按“2.1”“2.2”项下实验条件1 d内重复进样6次, 计算各对照品峰面积的RSD范围为1.0%~3.0%, 表明本方法精密度良好; 分别称取6份同一样品粉末, 按“2.4”项下方法制备供试品溶液, 并按“2.1”“2.2”项下实验条件进样分析, 计算33种成分含量的RSD范围为1.3%~4.9%, 表明本方法重复性良好; 取竹节参供试品溶液, 按“2.1”“2.2”项下实验条件进样, 分别在0、2、4、8、12、24 h测定, 计算33种成分含量的RSD为1.2%~4.6%, 表明该供试品溶液在24 h内稳定。
2.5.3 加样回收试验
取已知含量的样品9份, 每份约0.25 g, 精密称定, 置于具塞锥形瓶中, 分别按已知浓度的80%、100%、120%加入一定量的各对照品溶液(每个水平3份), 按“2.4”项下方法制备加样回收率供试品溶液, 并按“2.1”“2.2”项下实验条件进样, 计算得到各成分的平均回收率范围为96.90%~101.6%, RSD的范围为1.1%~3.6%。
2.6 样品含量测定
取供试品溶液2 μL注入液相色谱-质谱仪, 按照“2.1”“2.2”项下实验条件测定, 根据相关线性方程分别计算供试品溶液中33种目标成分的含量。根据SPSS 22.0独立样本t检验结果显示, 根与根茎中33种成分含量除人参皂苷Rc(P=0.040)具有显著性差异外, 其余成分含量的差异并无统计学意义(P>0.05)。竹节参根与根茎的总含量及百分含量比较图见图 3。从氨基酸、核苷、皂苷总含量来看, 根茎略高。而两者在各成分组成上相似。
2.7 系统聚类及非线性映射分析
对竹节参根与根茎中33种活性成分的含量, 采用SPSS 22.0对其进行系统聚类分析, 采用离差平方和法(Ward’s method), 根据欧式平方距离远近来获得样品的相似度情况, 具体结果见图 4。当类间距离位于20时, 样品可以聚为2类, R12、RM11、R11、RM12、RM6、R13、RM13、R6、R7、RM7聚为一类, 其余样品聚为一类, 其中6、7、12和13均来自产地四川, 可见四川产地的竹节参较为相似, 且基本上来自同一产地的根和根茎相距不远, 较难分开, 由此表明根与根茎较为相似。由于为了较为真实且全面反映样品间的相互关系, 同时采用非线性映射(采用DPS 7.5软件)对样品进行分析。非线性映射分析可通过非线性变换, 将高维空间中的图像变换到二维空间的图像[15]。如图 5, RM9距离其他样品差异较大, 但总体上根与根茎间差异并不明显。上述2种分析方法得出的结果相似, 表明结果可靠。
2.8 主成分分析
对竹节参根与根茎样品中33种活性成分进行主成分分析。采用MATLAB R2016a进行分析, 对33种活性成分的含量进行标准化处理(将某变量中的观察值减去该变量的平均数, 然后除以该变量的标准差), 其中主成分的方差贡献率累积图, 标准化处理后7个主成分的方差贡献率、累积方差贡献率及特征值分别见图 6~7。当到第7个主成分时, 累积方差贡献率已达到83.929%, 能较为全面地反映样品的整体信息, 故提取前7个主成分。为了从主成分(PCA)模型中获取更多样品化学组成差异的信息, 提取了PCA模型的载荷因子。载荷的绝对值越大, 表明对主成分的贡献越大。从第一主成分的组成来看, 各标准化后的变量中, 氨基酸中以L-亮氨酸、L-丙氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-亮氨酸的贡献较大, 核苷中以尿苷、鸟苷、腺苷、胞苷、2’-脱氧鸟苷的贡献较大, 皂苷中以伪人参皂苷F11、人参皂苷Rd、竹节参皂苷Ⅳ的贡献较大。
以各成分的方差贡献率作为权重, 建立竹节参根与根茎综合质量评价函数(Y=0.296 46PC1+0.184 63PC2+0.133 43PC3+0.097 62PC4+0.050 74PC5+0.040 97PC6+0.035 45PC7), 计算各样品的综合得分, 结果见表 4。RM9、RM1(0.000)评分较高, R13、RM13、RM7、R7评分较低(< -0.5), 其余样品综合评分均在-0.5~-0之间。根与根茎评分接近, 尤其是同一来源的根与根茎。
表 4 竹节参根与根茎样品的主成分得分、综合得分(从低到高)Table 4. Principal component scores, comprehensive evaluation in roots and rhizomes of Panax japonicus (from low to high)样品 主成分得分 综合得分 PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 R7 -3.882 -1.972 -2.568 1.078 -0.883 -0.659 -1.074 -1.862 RM7 -3.816 -3.094 -4.928 2.656 0.141 -0.615 0.542 -1.270 RM13 -3.747 0.424 0.247 0.018 1.684 -1.276 -1.727 -0.878 R13 -3.704 1.464 0.195 1.666 1.714 -1.561 1.112 -0.617 R4 -3.175 -1.800 3.536 -0.227 -0.828 -0.098 -0.079 -0.390 RM12 -2.849 4.628 0.799 0.918 -0.719 -0.309 -0.790 -0.326 RM4 -2.832 -2.537 3.909 -0.709 1.274 1.215 -1.118 -0.281 R6 -2.801 2.009 -1.471 0.068 -0.608 0.177 0.859 -0.249 RM6 -1.877 5.367 -1.637 -0.160 2.075 2.606 0.991 -0.202 RM3 -1.204 -1.815 2.460 -1.098 -0.019 -0.228 1.051 -0.160 R10 -0.997 -1.434 3.092 -0.963 0.386 -0.818 -0.376 -0.121 RM11 -0.725 2.147 -0.440 0.075 -1.082 -0.432 -0.609 -0.100 R12 -0.535 3.189 0.209 -0.085 -2.694 0.499 0.111 -0.086 RM8 -0.390 -1.127 0.417 -0.303 1.329 0.076 2.892 -0.068 R8 0.190 -1.167 0.596 -1.302 -1.286 0.030 0.913 -0.054 RM10 0.467 -0.661 0.840 -0.791 0.174 -0.164 0.500 -0.041 RM5 0.857 -1.567 -1.814 -2.117 1.466 1.960 -1.808 -0.029 R11 1.231 4.324 0.051 -0.574 -1.473 -0.387 -1.262 -0.023 R3 1.676 -1.039 1.764 -1.103 -1.294 -0.217 0.674 -0.017 R9 2.127 -1.508 -3.654 -3.485 1.143 -0.875 -0.387 -0.012 R5 2.586 -1.014 -1.738 -3.293 -0.655 1.042 -0.384 -0.009 R2 2.739 -2.012 -1.482 0.556 -2.042 0.766 0.978 -0.007 RM2 3.247 -1.268 0.424 3.086 0.016 1.928 0.416 -0.004 R1 4.016 -2.331 -0.969 1.897 -0.373 -1.730 -0.688 -0.002 RM1 5.008 -0.710 1.485 4.579 0.794 1.224 -1.211 0.000 RM9 8.391 3.504 0.677 -0.386 1.759 -2.154 0.472 0.000 3. 讨论
3.1 色谱条件的优化
考察甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水与0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水等不同流动相, 结果表明, 0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水时, 各色谱峰峰形及分离较好。因此本实验选择0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相梯度洗脱。考察Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、Thermo AcclaimTM RSLC 120 C18柱(150 mm×2.1 mm, 2.2 μm)、SynergiTM Hydro-RP 100Å柱(2.0 mm×100 mm, 2.5 μm)、XBridge®C18(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm), 结果表明, XBridge®C18(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm)对上述3类成分具有较好的分离度与灵敏度, 故本实验选择XBridge®C18(4.6 mm×100 mm, 3.5 μm)作为色谱柱。
3.2 质谱条件的优化
根据33种成分在正负离子模式下的响应程度, 结果表明, 氨基酸类、核苷类及假人参皂苷RT1、人参皂苷Rb1在正离子模式下有更好的响应, 所以选择正离子模式。其他皂苷类成分在负离子模式下有更好的响应, 所以选择负离子模式。
3.3 供试品制备方法的优化
以竹节参皂苷Ⅳa和人参皂苷R0含量作为指标, 选用超声提取法, 对提取溶剂(50%、70%、90%甲醇、乙醇、水)、药液比(1∶10、1∶20、1∶30)和提取时间(30、60、90 min)进行单因素考察, 结果表明提取溶剂为70%甲醇时, 药液比为1∶20、提取时间60 min时, 两者总含量较高。综上, 提取溶剂、药液比和提取时间分别为70%甲醇、1∶20、60 min。
本实验建立了UFLC-QTRAP-MS/MS同时测定竹节参根与根茎中皂苷、氨基酸及核苷类共33种指标成分含量的方法, 并结合聚类、非线性映射及主成分分析对竹节参根与根茎样品中33种目标成分进行比较分析与综合评价。聚类与非线性映射分析结果均显示从33种成分含量的角度, 竹节参的根与根茎两者较为相似, 难以区分; 主成分分析结果也表明竹节参根与根茎的综合得分较为接近, 两者相似。综上所述, 从33种成分含量的角度, 竹节参的根与根茎两者相似, 所建立的方法准确、可靠, 可用于竹节参药材内在质量的综合评价, 该研究可为竹节参根的开发利用提供基础资料。
-
表 1 竹节参样品信息
Table 1 Information of samples of Panax japonicus
样品 产地 R1(根), RM1(根茎) 湖北恩施(栽培) R2(根), RM2(根茎) 湖北恩施(栽培) R3(根), RM3(根茎) 湖北恩施(栽培) R4(根), RM4(根茎) 湖北恩施(栽培) R5(根), RM5(根茎) 四川巴中(栽培) R6(根), RM6(根茎) 四川普洱(栽培) R7(根), RM7(根茎) 四川普洱(栽培) R8(根), RM8(根茎) 云南文山(栽培) R9(根), RM9(根茎) 湖北恩施(栽培) R10(根), RM10(根茎) 湖北恩施(栽培) R11(根), RM11(根茎) 江西遂川(野生) R12(根), RM12(根茎) 四川成都(野生) R13(根), RM13(根茎) 四川乐山(野生) 表 2 优化的质谱条件参数
Table 2 Optimized MS/MS parameters
化合物 分子式 tR/min MRM参数 离子对m/z 碰撞电压/V 碰撞能量/eV 离子模式 L-His C6H9N3O2 1.15 156.080/110.030 100.00 16.00 ESI+ L-Arg C6H14N4O2 1.17 175.120/70.020 100.00 18.00 ESI+ L-Ser C3H7NO3 1.24 106.050/59.990 100.00 8.00 ESI+ L-Ala C3H7NO2 1.25 90.060/44.020 100.00 10.00 ESI+ L-Asp C4H7NO4 1.25 134.050/87.960 59.00 10.00 ESI+ L-Thr C4H9NO3 1.27 120.070/74.000 100.00 20.00 ESI+ L-Pro C5H9NO2 1.35 116.070/70.020 68.00 10.00 ESI+ 2'-Deoxycyt C9H13N3O4 1.45 228.200/112.053 76.00 13.00 ESI+ Cyt C9H13N3O5 1.85 244.090/112.000 61.00 10.00 ESI+ L-Met C5H11NO2S 2.02 150.060/104.030 91.00 10.00 ESI+ Uri C10H13N5O5 2.51 244.896/113.000 10.00 13.00 ESI+ L-Isoleu C6H13NO 3.01 132.100/86.050 100.00 10.00 ESI+ L-Leu C6H13NO2 3.31 132.100/86.050 100.00 10.00 ESI+ Ade C10H13N5O4 3.34 268.100/136.070 86.00 23.00 ESI+ Gua C10H13N5O5 3.89 284.300/152.000 62.00 15.00 ESI+ Ino C10H12N4O5 3.95 269.000/137.070 46.00 15.00 ESI+ 2'-Deoxygua C10H13N5O4 4.42 268.100/152.100 61.00 15.00 ESI+ L-Phe C9H11NO2 6.45 166.100/120.050 100.00 14.00 ESI+ Thy C10H14N2O5 6.59 243.100/127.070 61.00 13.00 ESI+ N-R1 C47H80O18 9.01 932.412/638.300 -225.00 -50.00 ESI- G-Rg1 C42H72O14 9.66 845.680/637.400 -20.00 -35.00 ESI- G-Re C48H82O18 9.68 991.700/799.400 -120.00 -45.00 ESI- G-Rb1 C54H92O23 10.50 1109.600/352.00 111.00 31.00 ESI+ G-Rc C53H90O22 10.70 1077.600/1077.600 -120.00 -60.00 ESI- G-Rb2 C53H90O22 10.80 1077.600/1077.600 -120.00 -60.00 ESI- P-F11 C42H72O14 10.90 845.400/653.400 -110.00 -50.00 ESI- G-Ro C48H76O19 11.00 955.585/793.400 -5.00 -60.00 ESI- N-R2(20S) C41H70O13 11.10 769.427/637.400 -25.00 -38.00 ESI- G-Rg2(20S) C42H72O13 11.30 829.600/637.400 -20.00 -40.00 ESI- P-RT1 C47H74O18 11.40 949.380/641.300 261.00 55.00 ESI+ C-Ⅳ C47H74O18 11.40 926.000/569.300 -15.00 -60.00 ESI- G-Rd C48H82O18 11.50 991.700/783.400 -120.00 -55.00 ESI- C-Ⅳa C42H66O14 11.90 793.530/631.200 -185.00 -58.00 ESI- 表 3 33种成分的回归方程、相关系数、检测限和定量限
Table 3 Linear regression equations, correlation coefficients, limits of detection and limits of quantification of 33 compounds
化合物 标准曲线 r 线性范围/(ng·mL-1) LOD/(ng·mL-1) LOQ/(ng·mL-1) L-His Y=128X+1.74×103 0.999 6 4.5~900 0.27 0.81 L-Arg Y=44.2X+1.08×104 0.999 4 21~3.36×105 2.08 6.25 L-Ser Y=2.32X+2.54×103 0.999 1 1.4~5.6×104 0.33 0.99 L-Ala Y=2.57X+553 0.999 7 32.7~1.044×105 3.76 11.28 L-Asp Y=206X+1.44×104 0.999 7 8.5~1.36×104 1.07 3.22 L-Thr Y=5.39X+537 0.999 3 0.67~2.7×104 0.13 0.39 L-Pro Y=142X+1.14×105 0.999 6 12.8~2.56×105 3.39 10.16 2’-Deoxycyt Y=393X-946 0.999 7 1.5~300 0.25 0.75 Cyt Y=209X+274 0.999 7 0.85~6.78×103 0.25 0.75 L-Met Y=72X+697 0.999 2 0.75~2.4×103 0.15 0.45 Uri Y=1 740X-4.83×104 0.999 7 29.9~5.98×103 1.50 4.50 L-Isoleu Y=188X+2.27×104 0.999 4 2.33~1.862×104 0.23 0.69 L-Leu Y=79.5X+3.33×104 0.999 3 25.6~4.08×104 5.12 15.36 Ade Y=3 950X+4.11×104 0.999 6 1.56~1.248×104 0.17 0.51 Gua Y=359X+2.28×105 0.999 3 12.8~1.28×105 2.02 6.06 Ino Y=4 650X+1.12×105 0.999 7 12.4~4.97×103 2.48 7.44 2’-Deoxygua Y=3 950X-2.88×105 0.999 7 1.5~300 0.15 0.45 L-Phe Y=124X+891 0.999 4 0.65~2.58×104 0.13 0.39 Thy Y=178X-403 0.999 4 4.12~1.65×103 0.82 2.46 N-R1 Y=8.96X+222 0.999 6 12.7~1.014×104 2.54 7.62 G-Rg1 Y=54.2X+1.15×104 0.999 3 7.23~2.312×105 1.45 4.35 G-Re Y=3.85X+3.17×103 0.999 4 33.3~5.32×105 6.65 19.95 G-Rb1 Y=54.3X+3.95×103 0.999 9 12.5~1.002×105 2.51 7.53 G-Rc Y=27.5X-280 0.999 7 12.5~4.99×103 0.25 0.75 G-Rb2 Y=6.32X+234 0.999 8 3.7~7.4×103 1.11 3.33 P-F11 Y=140X+1.85×104 0.999 4 19.2~1.232×105 3.84 11.52 G-Ro Y=15.4X+2.34×104 0.999 1 61.2~2.44×105 4.90 14.70 N-R2(20S) Y=3.47X+1.1×103 0.999 5 6.78~2.71×104 1.36 4.08 G-Rg2(20S) Y=202X+4.26×103 0.999 1 3.35~1.072×105 0.67 2.01 P-RT1 Y=7.97X+1.29×104 0.999 1 31.2~1×106 6.24 18.72 C-Ⅳ Y=16.9X+1.17×103 1.000 0 110~4.4×105 6.13 18.40 G-Rd Y=15.6X+1.04×104 0.999 9 31.4~1.26×105 6.28 18.84 C-Ⅳa Y=64.2X+8.91×104 0.999 3 8.29~3.32×105 0.81 2.43 表 4 竹节参根与根茎样品的主成分得分、综合得分(从低到高)
Table 4 Principal component scores, comprehensive evaluation in roots and rhizomes of Panax japonicus (from low to high)
样品 主成分得分 综合得分 PC1 PC2 PC3 PC4 PC5 PC6 PC7 R7 -3.882 -1.972 -2.568 1.078 -0.883 -0.659 -1.074 -1.862 RM7 -3.816 -3.094 -4.928 2.656 0.141 -0.615 0.542 -1.270 RM13 -3.747 0.424 0.247 0.018 1.684 -1.276 -1.727 -0.878 R13 -3.704 1.464 0.195 1.666 1.714 -1.561 1.112 -0.617 R4 -3.175 -1.800 3.536 -0.227 -0.828 -0.098 -0.079 -0.390 RM12 -2.849 4.628 0.799 0.918 -0.719 -0.309 -0.790 -0.326 RM4 -2.832 -2.537 3.909 -0.709 1.274 1.215 -1.118 -0.281 R6 -2.801 2.009 -1.471 0.068 -0.608 0.177 0.859 -0.249 RM6 -1.877 5.367 -1.637 -0.160 2.075 2.606 0.991 -0.202 RM3 -1.204 -1.815 2.460 -1.098 -0.019 -0.228 1.051 -0.160 R10 -0.997 -1.434 3.092 -0.963 0.386 -0.818 -0.376 -0.121 RM11 -0.725 2.147 -0.440 0.075 -1.082 -0.432 -0.609 -0.100 R12 -0.535 3.189 0.209 -0.085 -2.694 0.499 0.111 -0.086 RM8 -0.390 -1.127 0.417 -0.303 1.329 0.076 2.892 -0.068 R8 0.190 -1.167 0.596 -1.302 -1.286 0.030 0.913 -0.054 RM10 0.467 -0.661 0.840 -0.791 0.174 -0.164 0.500 -0.041 RM5 0.857 -1.567 -1.814 -2.117 1.466 1.960 -1.808 -0.029 R11 1.231 4.324 0.051 -0.574 -1.473 -0.387 -1.262 -0.023 R3 1.676 -1.039 1.764 -1.103 -1.294 -0.217 0.674 -0.017 R9 2.127 -1.508 -3.654 -3.485 1.143 -0.875 -0.387 -0.012 R5 2.586 -1.014 -1.738 -3.293 -0.655 1.042 -0.384 -0.009 R2 2.739 -2.012 -1.482 0.556 -2.042 0.766 0.978 -0.007 RM2 3.247 -1.268 0.424 3.086 0.016 1.928 0.416 -0.004 R1 4.016 -2.331 -0.969 1.897 -0.373 -1.730 -0.688 -0.002 RM1 5.008 -0.710 1.485 4.579 0.794 1.224 -1.211 0.000 RM9 8.391 3.504 0.677 -0.386 1.759 -2.154 0.472 0.000 -
[1] ZHANG H, WANG HF, LIU Y, et al. The haematopoietic effect of Panax japonicus on blood deficiency model mice[J]. J Ethnopharmacol, 2014, 154(3): 818-824. DOI: 10.1016/j.jep.2014.05.008
[2] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典: 一部[S]. 北京: 中国医药科技出版社, 2015. Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China: Ⅰ[S]. Beijing: China medical science and technology press, 2015.
[3] 武秋爽, 陈平, 张庆文. 竹节参化学成分、药理活性及分析方法研究进展[J]. 亚太传统医药, 2016, 12(6): 46-54. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YTCT201606021.htm WU QS, CHEN P, ZHANG QW. Advances in research of chemical constituents, pharmacological activities and analytical methods of Panax japonicus[J]. Asia Pac Tradit Med, 2016, 12(6): 46-54. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-YTCT201606021.htm
[4] 李有贵. 竹节人参皂苷对乙醇性肝损伤的保护机理研究[D]. 杭州: 浙江大学, 2011. LI YG. The mechanistic approach of saponins from Panax japonicus for treatment of alcohol-induced hepatic injury[D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2011.
[5] DUN YY, LIU M, CHEN J, et al. Regulatory effects of saponins from Panax japonicus on colonic epithelial tight junctions in aging rats[J]. J Ginseng Res, 2018, 42(1): 50-56. DOI: 10.1016/j.jgr.2016.12.011
[6] HE HB, XU J, XU YQ, et al. Cardioprotective effects of saponins from Panax japonicus on acute myocardial ischemia against oxidative stress-triggered damage and cardiac cell death in rats[J]. J Ethnopharmacol, 2012, 140(1): 73-82. DOI: 10.1016/j.jep.2011.12.024
[7] 张开强, 韦荣编, 宋茹, 等. 北太平洋鱿鱼(Todarodes pacificus)内脏自溶液总氨基酸组成质量评价和体外抗氧化性分析[J]. 食品科学, 2017, 38(1): 238-243. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SPKX201701046.htm ZHANG KQ, WEI RB, SONG R, et al. Assesment of total amino acids and antioxidant activity of squid(Todarodes pacificus) viscera autolysates[J]. Food Sci, 2017, 38(1): 238-243. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-SPKX201701046.htm
[8] 陈丽云, 祁真. 冬虫夏草氨基酸成分的药理作用分析[J]. 中国卫生工程学, 2018, 17(5): 675-677. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGWX201805011.htm CHEN LY, QI Z. Analysis of amino acid composition and the pharmacology of cordyceps sinensis[J]. Chin J Public Health Eng, 2018, 17(5): 675-677. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGWX201805011.htm
[9] 田晓芳, 王晓雪, 李朋梅, 等. 基于代谢组学的心肌缺血药理学研究进展[J]. 中国药学杂志, 2016, 51(20): 1726-1729. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYX201620002.htm TIAN XF, WANG XX, LI PM, et al. Pharmacological research progress of myocardial ischemia based on the metabonomics[J]. Chin Pharm J, 2016, 51(20): 1726-1729. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZGYX201620002.htm
[10] 艾中, 钱正明, 李文佳, 等. 冬虫夏草核苷类成分分析研究进展[J]. 菌物学报, 2016, 35(4): 388-403. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-JWXT201604004.htm AI Z, QIAN ZM, LI WJ, et al. Recent advances in the analysis of nucleosides in Chinese cordyceps[J]. Mycosystema, 2016, 35(4): 388-403. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-JWXT201604004.htm
[11] 丁兴杰, 熊亮, 周勤梅, 等. 天然核苷类成分的化学结构和药理活性研究进展[J]. 成都中医药大学学报, 2018, 41(2): 102-108. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CDZY201802029.htm DING XJ, XIONG L, ZHOU QM, et al. Advances in studies on chemical structure and pharmacological activities of natural nucleosides[J]. J Chengdu Univ Tradit Chin Med, 2018, 41(2): 102-108. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-CDZY201802029.htm
[12] 杨小舟, 崔铁军, 解莹, 等. 核苷类药物对恶性肿瘤患者化疗后乙型肝炎病毒再激活的研究[J]. 中华医院感染学杂志, 2016, 26(2): 289-291, 297. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZHYY201602020.htm YANG XZ, CUI TJ, XIE Y, et al. Effect of nucleoside analogues on reactivation of hepatitis B virus in patients with malignancies after chemotherapy[J]. Chin J Nosocomiology, 2016, 26(2): 289-291, 297. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZHYY201602020.htm
[13] WU QS, WANG CM, LU JJ, et al. Simultaneous determination of six saponins in panacis japonici rhizoma using quantitative analysis of multi-components with single-marker method[J]. Curr Pharm Anal, 2017, 13(3): 289-295.
[14] MENG FC, WU QS, WANG RB, et al. A novel strategy for quantitative analysis of major ginsenosides in panacis japonici rhizoma with a standardized reference fraction[J]. Molecules, 2017, 22(12): 2067.
[15] 汪红, 王强. 非线性映射法用于鼠尾草属植物的分析鉴定[J]. 中国野生植物资源, 2006, 25(4): 51-54. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZYSZ200604014.htm WANG H, WANG Q. The application of nonlinear mapping in the identification of Salvia plants[J]. Chin Wild Plant Resour, 2006, 25(4): 51-54. https://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTOTAL-ZYSZ200604014.htm