Research on the Effect and Mechanism of Qingchang Huashi Recipe on Relieving Colitis in Mice through AhR/IL-22
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摘要: 目的 通过构建溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)小鼠模型, 从芳香烃受体(AhR)角度, 观察清肠化湿方对白细胞介素-22(IL-22)分泌及黏蛋白-2(MUC-2)与紧密连接蛋白(Claudin4)表达的作用, 阐述其缓解小鼠UC的作用机制。 方法 用DSS构建UC小鼠模型, 每日观察小鼠体质量、粪便形状、隐血情况, 同时进行疾病活动指数(DAI)评分。给药结束后测量小鼠结肠长度，HE染色观察结肠病理情况，qPCR检测结肠组织白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、AhR的mRNA。Western blot检测结肠MUC-2、AhR、细胞色素P4501A1酶(CYP1A1)、IL-22、Claudin4表达水平。 结果 与正常组比较, 模型组小鼠DAI评分上升(P < 0.01), 结肠长度缩短(P < 0.01), 结肠黏膜病理受损情况严重; AhR的mRNA表达下降(P < 0.05), IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达上升(P < 0.05，P < 0.01);MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白表达下降(P < 0.05, P < 0.01)。与模型组比较, 美沙拉嗪组、清肠化湿方组DAI评分降低(P < 0.01), 结肠长度变长(P < 0.01), 结肠黏膜病理情况改善; IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达下降(P < 0.05，P < 0.01);MUC-2、CYP1A1、Claudin4蛋白表达升高(P < 0.01)。与模型组比较, 清肠化湿方组AhR的mRNA表达上升(P < 0.05)，AhR、IL-22蛋白表达升高(P < 0.01)。与清肠化湿方组比较, 清肠化湿方+TMF组小鼠DAI评分上升(P < 0.01);结肠长度缩短(P < 0.05);结肠黏膜病理受损情况严重; IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达上升(P < 0.01);MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白表达下降(P < 0.01)。 结论 清肠化湿方能够激活AhR, 上调CYP1A1表达, 促进IL-22生成, 抑制炎症水平, 同时增加MUC-2及Claudin4的表达, 从而缓解UC。Abstract: OBJECTIVE To explore the therapeutic effect of Qingchang Huashi recipe on colitis model mice, and explore from the perspective of aromatic hydrocarbon receptor(AhR), to explore the effect of Qingchang Huashi recipe on IL-22 secretion and mucin and tight junction protein expression, and to explain alleviate the mucosal damage mechanism of colitis model mice, so as to provide objective basis for clinical application and drug research and development. METHODS The mouse model of colitis was established by DSS, the body mass, fecal shape, occult blood and DAI score of disease activity index were observed every day. The colon length of mice was measured after administration, and the colonic pathology was observed by HE staining. qPCR was used to detect the mRNA of IL-1β, TNF-α, IL-6 and AhR in colon tissue. The expression levels of colonic mucin(MUC-2), AhR, cytochrome 4501A1(CYP1A1), interleukin-22(IL-22) and tight junction protein (Claudin4) were detected by Western blot. RESULTS Compared with the normal group, the DAI score of the model group increased(P < 0.01), the length of colon shortened(P < 0.01), the pathological damage of colonic mucosa was severe, the mRNA expression of AhR decreased(P < 0.05), the mRNA expression of IL-1 β, TNF-α and IL-6 increased (P < 0.05, P < 0.01). The expressions of MUC-2, AhR, CYP1A1, IL-22 and Claudin4 decreased(P < 0.05). Compared with the model group, the DAI score of mesalazine group and Qingchang Huashi Recipe group decreased(P < 0.01), the length of colon lengthened(P < 0.01), the pathological condition of colonic mucosa improved, the mRNA expression of IL-1β, TNF-α and IL-6 decreased (P < 0.05, P < 0.01). The expressions of MUC-2, CYP1A1, Claudin4 protein increased(P < 0.01). Compared with the model group, the mRNA expression of AhR increased(P < 0.05). The expression of AhR and IL-22 protein in Qingchang Huashi Recipe group increased(P < 0.01). Compared with the Qingchang Huashi Recipe group, the DAI score of the Qingchang Huashi Recipe+TMF group increased(P < 0.01), the length of colon was shortened(P < 0.05), the pathological damage of colonic mucosa was serious, the mRNA expression of IL-1β, TNF-α, IL-6 increased(P < 0.01), the expressions of MUC-2, AHR, CYP1A1, IL-22 and Claudin4 decreased(P < 0.01). CONCLUSION Qingchang Huashi Recipe can activate AhR, to up-regulate CYP1A1 protein, promote the production of IL-22, inhibit the level of inflammation, increase the expression of mucin and tight junction protein, and relieve colitis.
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Keywords:
- ulcerative colitis /
- Qingchang Huashi Recipe /
- AhR /
- IL-22
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溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis, UC)是一种慢性非特异性胃肠道炎性疾病, 病程常超过6周, 患者以腹泻、腹痛、黏液脓血便等为主[1]。近年来, 其发病率逐年上升[2]。中医学无“溃疡性结肠炎”之说, 参照其症状, 将其归为古籍“久痢”“肠澼”“泄泻”之类[3]。治疗时, 西医多用传统药物(5-氨基水杨酸类药物、糖皮质激素、免疫抑制剂)、生物制剂、营养支持治疗与外科手术治疗等[4], 中医常用多种方式联合治疗, 包括口服中药、灌肠、针灸等。UC病机总属本虚标实, 沈洪教授认为UC活动期患者病机当属湿热之邪壅滞肠膜, 损伤肠络, 导致气血失调, 其结合多年临证经验及现代研究, 针对湿热病机, 运用清肠化湿方治疗UC疗效可靠[5]。本方由白头翁、白芍、黄芩、地榆、白芷等药物组成, 共奏清热除湿、凉血止痢之效。
芳香烃受体(Aryl hydrocarbon receptor, AhR)属于螺旋-环-螺旋超家族, 多以未活化的方式广泛表达于多种细胞的胞浆中, 一旦被特应性的配体激活, AhR便进入细胞核并与AhR核转位子结合形成二聚体, 启动一系列下游目的基因的表达。AhR可以促进Th17细胞和3型先天淋巴细胞(ILC3)产生白介素(IL)-22, 并对其有重要的调节作用[6]。此外, 肠道微生物还可以通过影响AhR配体来调节IL-22的产生。IL-22可以由不同的细胞产生, 比如活化的T细胞、NK细胞等, 而在肠道中, ILC3是IL-22的主要来源[7]。ILC3主要通过分泌细胞因子调节炎症, 其功能的维持与AhR的活性密切相关[8]。IL-10和IL-22有共同的β链IL-10Rβ, 负责信号传递[9]。肠道微生物产生的部分代谢产物能够结合并激活AhR, 被激活的AhR可诱导下游细胞因子IL-22的表达, 从而调节肠道内环境的稳态。
前期研究表明清肠化湿方能够减轻UC小鼠炎症免疫反应, 影响Th17分化, 促进IL-10分泌, 诱导肠干细胞再生[10]。但本方是否通过影响AhR及肠道黏膜屏障, 进而影响IL-22分泌及黏蛋白(MUC-2)与紧密连接蛋白(Claudin4)的表达尚未明确, 因此本研究旨在探讨本方的相关作用机制, 并为未来的科学研究提供理论支撑。
1. 材料与方法
1.1 动物
48只雄性SPF级6~8周龄C57BL/6小鼠, 体质量20~22 g, 购自浙江维通利华实验动物技术有限公司。动物许可证号：SCXK(浙)2019-0001。在南京中医药大学实验动物中心动物房饲养。小鼠适应环境1周(每日自由进食饮水), 温度24~25 ℃, 湿度50%~60%, 每日12 h光照, 12 h避光。
1.2 药物与试剂
清肠化湿方(白头翁15 g, 白芍15 g, 黄芩10 g, 白芷10 g, 地榆15 g, 黄芪15 g)中药购自江苏省中医院药房。经南京市药品检验所质量检验, 鉴定为合格中药饮片。称取清肠化湿方生药, 用1 200 mL蒸馏水浸泡60 min, 煎煮60 min, 滤过收集煎煮液; 剩余药渣用1 200 mL蒸馏水, 二次煎煮60 min, 滤过收集煎煮液。合并2次药液, 4 ℃ 4 000×g离心10 min, 取上清, 浓缩成12 g·kg-1水煎剂。DSS(分子量: 36 000~50 000 kDa, 美国MP Biomedicals公司, 货号: 0216011050);美沙拉嗪肠溶片(佳木斯鹿灵制药有限公司, 货号: 190311), 经研磨配成0.3 g·mL-1混悬液; AhR拮抗剂6, 2', 4'-Trimethoxyflavone(TMF，Sigma公司, 货号: T4080), 浓度配成5 mg·kg-1; 抗体MUC-2(ab272692)、AhR(sc-133088)、细胞色素P450 1A1(CYP1A1)(sc-25304)、IL-22(ABP57408)、Claudin4(ab15104)、β-actin(sc-47778);TrizolTM Reagent RNA提取剂(Ambion公司, 货号: 15596026);HiScriptⅡ QRT SuperMix for qPCR, ChamQ UNiversal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme公司, 货号: R223-01, Q711-02/03);PCR引物(Invitrogen公司, 货号: HG1910090009);MDF-38超低温冰箱(日本三洋公司); 7500 fast荧光定量PCR仪(美国ABI公司); PowerPac Basic电泳仪, Mini PROTEAN Tetra Cell电泳槽(美国Bio-Rad公司); Mini PROTEAN Tetra Cell转膜槽(美国Bio-Rad公司); CHEMIDOC XRS+凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司); CKX41倒置相差显微镜(日本Olympus公司); 5804R超速离心机(德国Eppendorf公司); ELX-800酶标仪(美国BioTek公司)。
1.3 分组及模型制备
48只小鼠随机分为正常组(Ctrl)、模型组(DSS)、美沙拉嗪组(5-ASA)、清肠化湿方组(QCHS), 清肠化湿方+TMF组(QCHS+TMF)、TMF组(TMF)。每组8只。除正常组外, 小鼠均饮用含2.5% DSS蒸馏水1周造成UC模型。美沙拉嗪组给予0.3 g·kg-1美沙拉嗪溶液灌胃, 清肠化湿方组按照12 g·kg-1中药灌胃。清肠化湿方+TMF组按照12 g·kg-1中药灌胃+5 mg·kg-1 TMF腹腔注射，TMF组按照5 mg·kg-1 TMF腹腔注射, 其余组给予0.9%生理盐水腹腔注射。灌胃及腹腔注射共10 d, 于第11天处死小鼠。
1.4 取材
取材时, 收集小鼠血清、结肠、结肠内容物。具体取材方法如下: 用镊子摘取小鼠眼球, 取血至离心机按照3 000 r·min-1离心10 min后, 收集上层血清, 保存于-80 ℃。采用颈椎脱臼法处死小鼠, 75%乙醇浸润小鼠, 沿腹中线剪开腹部皮肤、腹肌、腹膜, 暴露腹腔。分离回肠、结肠, 置于冰板上, 去除结肠表面脂肪组织, 测量长度并拍照, 取回肠于1.5 mL EP管, -80 ℃保存; 纵剖结肠, 取出结肠内容物置于1.5 mL EP管中, -80 ℃保存。将纵剖后的结肠用预冷的PBS冲洗干净, 在滤纸上吸干。取末端1 cm处的组织放入4%多聚甲醛中固定, 剩余组织-80 ℃保存。
1.5 检测指标及方法
1.5.1 一般情况、疾病活动指数(Disease activity index, DAI)及结肠长度变化
每天观察小鼠毛色、尿液颜色、精神状态等一般情况, 记录小鼠体质量、粪便质地及便血情况, 对小鼠进行DAI评分[11], 具体评分见表 1。
表 1 DAI评分标准体质量下降率/% 大便性状 便血情况 评分 0 正常 阴性 0 1~5 正常 隐血(+) 1 6~10 松散 隐血(++) 2 11~15 松散 隐血(+++) 3 >15 稀便 肉眼血便 4 注: DAI=(体质量下降率评分+大便性状评分+便血情况评分)/3。正常大便: 成形便; 松散大便: 糊状、半成形便, 不黏附于肛门; 稀便: 稀水样便, 可黏附于肛门。 1.5.2 结肠病理切片观察
将4%多聚甲醛中固定的组织进行常规石蜡包埋, 切片厚度为4~5 μm, 进行常规HE染色, 在光镜下观察并拍照。
1.5.3 Western blot检测小鼠结肠组织MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白水平
取出-80 ℃保存的结肠组织100 mg, 使用RIPA缓冲液与蛋白酶抑制剂混合, 离心匀浆, 用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白质浓度并计算出上样量。取蛋白样品在80 V, 30 min，120 V, 60 min条件下进行SDS-PAGE分析。转膜时, 恒流300 mA, 90 min。转膜后, 用5%脱脂牛奶进行封闭60 min。洗膜后将膜与抗体放在4 ℃下过夜, 次日用TBST 10 min洗膜3次, 常温二抗孵育60 min, 再用TBST 10 min洗膜3次。用增强化学发光(ECL)检测。用Image Lab软件分析化学发光信号。收集数据并从3个独立样本中分析。
1.5.4 qPCR检测结肠组织IL-1β、TNF-α、IL-6、AhR的mRNA水平
取小鼠结肠组织于1 mL Trizol中充分裂解后, 进行氯仿萃取及异丙醇沉淀, 75%乙醇洗涤, 溶于20 μL DEPC水中。测量RNA浓度及纯度合格后, 按照逆转录试剂盒说明书进行逆转录, 得到cDNA, 再以cDNA为模板进行扩增目的基因。反应体系为10 μL: SYBR qPCR Premix Ex Taq 5 μL, 上下引物各0.2 μL, DEPC水3.6 μL, DNA 1 μL。设置反应条件: 预变性(95 ℃, 30 s)循环1次; 扩增(95 ℃, 10 s; 60 ℃, 30 s), 循环40次; 溶解曲线(95 ℃, 15 s; 60 ℃, 60 s; 95 ℃, 10 s): 循环1次。引物由Invitrogen公司合成, 核苷酸序列见表 2。采用2-△△Ct方法对qPCR结果进行数据分析。
表 2 qPCR引物序列基因 引物 序列 GAPDH F 5'-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3' R 5'-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3' IL-1β F 5'-CTGTGTCTTTCCCGTGGACC-3' R 5'-CAGCTCATATGGGTCCGACA-3' TNF-α F 5'-TCAGCCGATTTGCTATCTCA-3' R 5'-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG-3' IL-6 F 5'-TTCCATCCAGTTGCCTTCTT-3' R 5'-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3' AhR F 5'-CAAAGGGCAGCTTATTCTGG-3' R 5'-GGTCTCTGAGTGGCGATGAT-3' 1.6 统计学方法
运用SPSS23.0软件对数据进行处理, 实验数据用x±s表示。若数据满足正态分布和方差齐性, 各组间采用单因素方差分析。各组间的两两比较采用LSD检验方法, 方差不齐则采用非参数秩和检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2. 结果
2.1 各组小鼠一般情况
正常组小鼠毛色正常, 行动灵敏, 饮食、粪便正常。模型组小鼠给2.5%DSS后出现进食量显著降低, 明显肉眼血便, 肛门口有血便附着, 体质量下降; 美沙拉嗪组、清肠化湿方组灌胃后, 毛色、活动状态、血便呈好转状态。清肠化湿方+TMF组、TMF组小鼠毛发光泽下降, 进食量降低, 见到肉眼血便, 体质量下降。各组小鼠体质量变化见图 1, 结肠形态见图 2。
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图 1 各组小鼠的体质量变化注: 与Ctrl组相比, * *P < 0.01;与DSS组相比, ##P < 0.01; 与QCHS组相比, △△P < 0.01。x±s，n=8。2.2 各组小鼠结肠长度及DAI评分
与正常组比较, 模型组小鼠结肠长度缩短(P < 0.01), DAI评分升高(P < 0.01)。与模型组比较, 美沙拉嗪组、清肠化湿方组小鼠结肠长度增加(P < 0.01), DAI评分降低(P < 0.01)。与清肠化湿方组比较, 清肠化湿方+TMF组小鼠结肠长度缩短(P < 0.05), DAI评分升高(P < 0.01)。见表 3。
表 3 各组小鼠DAI评分和结肠长度比较(x±s，n=8)组别 结肠长度/cm DAI评分 Ctrl 7.65±0.50 0 DSS 4.37±0.60** 3.06±0.88** 5-ASA 7.00±0.80## 0.94±0.14## QCHS 6.98±0.16## 1.11±0.17## QCHS+TMF 3.95±0.44△△ 2.94±0.65△△ TMF 3.93±0.36△△ 3.44±0.54△△ 注: 与Ctrl组相比, * *P < 0.01;与DSS组相比, ##P < 0.01;与QCHS组相比, △△P < 0.01。 2.3 各组小鼠结肠组织病理情况
正常组小鼠结肠组织结构完整清晰, 杯状细胞及隐窝结构未有破坏; 模型组可见溃疡形成, 未见隐窝, 黏膜糜烂。美沙拉嗪组及清肠化湿方组较模型组溃疡、黏膜损伤情况均明显减轻; 清肠化湿方+TMF组及TMF组可见溃疡, 腺体数量下降, 大量炎细胞浸润。见图 3。
2.4 各组小鼠结肠组织IL-1β、TNF-α、IL-6、AhR的mRNA水平
与正常组比较, 模型组小鼠IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达上升(P < 0.05，P < 0.01), AhR的mRNA表达下降(P < 0.05)。与模型组比较, 美沙拉嗪组、清肠化湿方组IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达下降(P < 0.05，P < 0.01), 清肠化湿方组AhR的mRNA表达上升(P < 0.05)。与清肠化湿方组比较, 清肠化湿方+TMF组小鼠IL-1β、TNF-α、IL-6的mRNA表达上升(P < 0.01)。见图 4。
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图 4 各组小鼠IL-1β、TNF-α、IL-6、AhR的mRNA表达比较注: 与Ctrl组相比, *P < 0.05, * *P < 0.01;与DSS组相比, #P < 0.05, ##P < 0.01;与QCHS组相比, △△P < 0.01。x±s，n=8。2.5 各组小鼠结肠组织MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白表达
与正常组比较, 模型组结肠组织中MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白表达下降(P < 0.05, P < 0.01);与模型组比较, 美沙拉嗪组、清肠化湿方组MUC-2、CYP1A1、Claudin4蛋白表达升高(P < 0.01);与模型组比较, 清肠化湿方组AhR、IL-22蛋白表达升高(P < 0.01)。与清肠化湿方组比较, 清肠化湿方+TMF组小鼠MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白表达下降(P < 0.01)。见图 5。
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图 5 各组小鼠结肠组织中MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白水平注: 与Ctrl组相比, *P < 0.05, * *P < 0.01;与DSS组相比, ##P < 0.01;与QCHS组相比, △△P < 0.01。x±s，n=8。3. 讨论
UC作为临床疑难病之一, 发病率在我国迅速上升。从中医角度分析, 其病机责之湿热二邪, 湿热蕴结脉络, 日久入于血分, 以致肠道受损, 传导失责, 最终出现腹痛、腹泻、黏液血便等症状。本方中白头翁、黄芩可清肠化湿解毒, 祛除湿热之邪, 以除病因之本; 白芍柔肝健脾, 同调肝脾; 地榆清热为主, 亦可止血, 以防出血之弊, 白芷止痛为先, 亦可燥湿; 加以生黄芪扶正御邪、调节免疫, 盖因黄芪尤擅补益脾肺之气, 培补土气则气血生化有源, 充盈肺气则固表御邪有力。
免疫因素是UC的关键发病机制之一[12]。AhR是一种转录因子[13], 在免疫细胞中高度表达, 可以介导一系列反应[14]。AhR可以促进Th17细胞和ILC3产生IL-22[15]。IL-22作为IL-10家族成员之一, 在炎症性肠病(IBD)患者中, 其分泌和功能调控可以推动细胞再生、防御、组织重构。IL-22的多种下游机制参与介导先天免疫、获得性免疫和组织稳态的调节。
CYP1A1是一种参与多种药物代谢的Ⅰ相酶, 是AhR的下游靶基因[16]。它受经典的AhR信号通路控制[17]。激活的AhR通过维持肠道干细胞稳态和屏障完整性来调节肠道内环境平衡[18]。研究表明IBD患者的肠道组织中, AhR的表达受到明显抑制, UC模型小鼠在使用AhR激动剂后, 其炎症得到显著缓解[19-20]。AhR在肠道中广泛表达, 其激活与UC的转归有关[21]。UC患者体内AhR的表达下调。研究表明, 在UC模型小鼠中, AhR的活化受到抑制, 表达下降, 说明AhR在肠道炎症中起到重要的作用[22]。活化的AhR可以促进IL-22的产生, 并对其有重要的调节作用, 从而抑制炎症[23]。
肠黏膜屏障由抗菌因子和黏液支撑, 可以阻止微生物破坏免疫系统[24-25]。UC患者的上皮功能和黏膜屏障受到破坏[26], 杯状细胞分泌的黏液组分减少, 肠道渗透性增加, 导致肠道微生物群的破坏[27]。黏蛋白是一种高度糖基化的O-糖蛋白, 由分泌上皮细胞产生, 在肠道内起到抵御病原体、有害物质的屏障作用。其中MUC-2是结肠中黏蛋白的主要成分, 在UC患者中, MUC-2的分泌减少, 因此恢复MUC-2水平可以改善UC[28]。有报道表明, UC会导致紧密连接蛋白水平显著下调, 肠道对微生物配体和有害代谢物的通透性显著增加, 从而导致全身炎症反应, 因此恢复肠道屏障的完整性对UC患者极为重要[29]。
课题组前期研究结果显示清肠化湿方组小鼠的色氨酸代谢增加, 色氨酸可以代谢产生内源性AhR配体, 从而维持肠道内环境的稳定和正常的新陈代谢。肠道内的大肠杆菌、变形杆菌、芽孢杆菌等都能将色氨酸代谢成吲哚及吲哚酸衍生物, 它们是AhR的微生物配体, 具有抗炎活性, 促进AhR活化及IL-22释放, 从而维持肠道内环境的稳定。
目前IL-22已成为UC药物研发的关键靶点之一, 本研究紧密结合疾病发病机制, 围绕免疫与肠黏膜屏障进行研究。实验结果表明清肠化湿方可以改善UC模型小鼠的肠道损伤, 促进UC的恢复。其机制可能通过激活AhR, 上调CYP1A1蛋白, 促进IL-22生成, 抑制炎症水平, 同时增加MUC-2及Claudin4的表达, 修复肠黏膜屏障, 从而缓解UC, 并为临床实践提供实验依据。
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图 1 各组小鼠的体质量变化
注: 与Ctrl组相比, * *P < 0.01;与DSS组相比, ##P < 0.01; 与QCHS组相比, △△P < 0.01。x±s，n=8。
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图 4 各组小鼠IL-1β、TNF-α、IL-6、AhR的mRNA表达比较
注: 与Ctrl组相比, *P < 0.05, * *P < 0.01;与DSS组相比, #P < 0.05, ##P < 0.01;与QCHS组相比, △△P < 0.01。x±s，n=8。
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图 5 各组小鼠结肠组织中MUC-2、AhR、CYP1A1、IL-22、Claudin4蛋白水平
注: 与Ctrl组相比, *P < 0.05, * *P < 0.01;与DSS组相比, ##P < 0.01;与QCHS组相比, △△P < 0.01。x±s，n=8。
表 1 DAI评分标准
体质量下降率/% 大便性状 便血情况 评分 0 正常 阴性 0 1~5 正常 隐血(+) 1 6~10 松散 隐血(++) 2 11~15 松散 隐血(+++) 3 >15 稀便 肉眼血便 4 注: DAI=(体质量下降率评分+大便性状评分+便血情况评分)/3。正常大便: 成形便; 松散大便: 糊状、半成形便, 不黏附于肛门; 稀便: 稀水样便, 可黏附于肛门。 
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表 2 qPCR引物序列
基因 引物 序列 GAPDH F 5'-CCATTTGCAGTGGCAAAG-3' R 5'-CACCCCATTTGATGTTAGTG-3' IL-1β F 5'-CTGTGTCTTTCCCGTGGACC-3' R 5'-CAGCTCATATGGGTCCGACA-3' TNF-α F 5'-TCAGCCGATTTGCTATCTCA-3' R 5'-CGGACTCCGCAAAGTCTAAG-3' IL-6 F 5'-TTCCATCCAGTTGCCTTCTT-3' R 5'-TCCACGATTTCCCAGAGAAC-3' AhR F 5'-CAAAGGGCAGCTTATTCTGG-3' R 5'-GGTCTCTGAGTGGCGATGAT-3'
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表 3 各组小鼠DAI评分和结肠长度比较(x±s，n=8)
组别 结肠长度/cm DAI评分 Ctrl 7.65±0.50 0 DSS 4.37±0.60** 3.06±0.88** 5-ASA 7.00±0.80## 0.94±0.14## QCHS 6.98±0.16## 1.11±0.17## QCHS+TMF 3.95±0.44△△ 2.94±0.65△△ TMF 3.93±0.36△△ 3.44±0.54△△ 注: 与Ctrl组相比, * *P < 0.01;与DSS组相比, ##P < 0.01;与QCHS组相比, △△P < 0.01。
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