UPLC/LTQ-Orbitrap-MS Combined with Network Pharmacology to Explore the Mechanism of Platycodon Grandiflorum in the Treatment of Nonalcoholic Fatty Liver Disease
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摘要:目的 结合UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术和网络药理学方法预测桔梗治疗非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的作用靶点及潜在的作用机制，并进行相关实验验证，为深入揭示桔梗治疗NAFLD的药效物质及作用机制奠定基础。方法 通过UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术及中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)数据库筛选桔梗的活性成分；使用Swiss Target Prediction数据库对桔梗的活性成分进行靶点预测；同时通过OMIM、Disgenet、TTD等数据库获取NAFLD靶点；将疾病相关靶点映射到化合物潜在靶点中，获取公共靶点，并将信息导入Cytoscape软件和String在线分析平台分别制作网络图和PPI图，同时进行拓扑学分析；基于R软件使用Bioconductor生物信息软件包进行关键靶基因GO与KEGG功能富集分析。构建NAFLD小鼠模型，通过病理染色切片，qPCR实验验证网络药理学富集分析结果。结果 结合质谱分析与数据库筛选结果，共获得桔梗活性成分13个，药物靶点278个，疾病靶点1 536个，共同靶点83个，涉及PI3K-AKT、胰岛素抵抗、TNF-α、IL-17、JAK-STAT、T细胞受体等信号通路。实验验证显示关键靶基因存在差异性表达。结论 该研究初步揭示了桔梗治疗NAFLD的活性成分及其作用机制，为后续的深入研究提供了参考价值。Abstract: OBJECTIVE Combining UPLC/LTQ-Orbitrap-MS technology with network pharmacology method to predict the target of Platycodon grandiflorum in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and the potential mechanism, and carrying out relevant experimental verification, in order to reveal the effective substances and mechanism of Platycodon grandiflorum in the treatment of NAFLD.METHODS The active components of Platycodon grandiflorum were screened by UPLC/LTQ-Orbitrap-MS and TCMSP database. Swiss Target Prediction Database was used to predict the active components of Platycodon grandiflorum. Targets of NAFLD were obtained through OMIM, Disgenet, TTD and other databases. The disease-related targets were mapped to the potential targets of compounds to obtain the common targets, and the information was imported into Cytoscape software and String online analysis platform to make network diagram and PPI diagram, respectively, and topological analysis was carried out at the same time. Functional enrichment analysis of key target genes GO and KEGG was carried out by using Bioconductor bioinformatics software package based on R software. NAFLD mouse model was established, the results of network pharmacology enrichment analysis were verified by pathological staining and qPCR.RESULTS Combined with the results of mass spectrometry and database screening, a total of 13 active components, 278 drug targets, 1 536 disease targets and 83 common targets were screened in Platycodon, involving PI3K-AKT, insulin resistance, TNF-α, IL-17, JAK-STAT, T cell receptors and other signaling pathways. Experimental verification showed that the key target genes were differentially expressed.CONCLUSION This study reveals the active components of Platycodon grandiflorum in the treatment of NAFLD and its mechanism of action, it provides reference value for further research.
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非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)作为一种常见的肝脏疾病，是代谢综合征在肝脏的疾病表现，是肥胖、胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压和高脂血症等相关疾病的集中反映[1-2]。NAFLD已成为21世纪全球重要的公共健康问题之一，亦是我国最常见的肝脏疾病，但尚未引起足够重视[3]。NAFLD因患病率高、低龄化发展趋势、慢性进展性成为隐源性肝硬化的重要成因，与肝癌发生有关，是肝功能衰竭的原因之一，因而临床防治价值凸显[4]。
中医学对NAFLD多从症状、病因病机等方面命名，2017年发布的《非酒精性脂肪性肝病中医诊疗专家共识意见》将其归属于“胁痛”“痞满”“肝胀”“痰证”“痰浊”“湿阻”“瘀证”等范畴[5]。
桔梗是药食同源的中药，《本草崇原》记载“桔梗，治少阳之胁痛”[6]；《本经》云“桔梗主胸胁痛如刀刺”[7]。现代药理研究表明，桔梗中富含的桔梗皂苷和桔梗多糖等成分具有抗氧化和消炎功效，可以通过介导小鼠的脂肪生成，抑制脂质过氧化和抗炎作用对酒精性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎起到治疗作用[8]。
网络药理学是从系统水平分析药物作用机制，通过构建药物-靶点-疾病网络来分析药物的作用机制[9]。本研究采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术及网络药理学方法预测桔梗治疗NAFLD可能的药效物质基础和作用靶点，并进行了相关实验验证，以期为后续的研究提供参考(图 1)。
1. 材料
1.1 仪器与试剂
LTQ Orbitrap XL型串联质谱仪(美国Thermo Fisher公司)；Ulti Mate 3000型超高效液相色谱(美国Thermo Fisher公司)；MJ mini梯度PCR仪(德国Eppendorf公司)；DMIL倒置显微镜(德国Leica公司)；高脂饲料(Research Diets D12492)；甘油三酯(TG)试剂、总胆固醇(TC)试剂盒均购自南京建成生物工程研究所；甲醇(色谱纯，美国Supelco公司)，水为超纯水。
1.2 数据库及软件
Xcalibur 2.1 SP1数据处理系统(美国Thermo Fisher公司)，Mass Frontier 7.0软件，TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，OMIM数据库(https://omim.org/)，Disgenet数据库(https://www.disgenet.org/)，TTD数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)，String数据库(https://string-db.org/)，Venny2.1在线软件作图工具平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，Cytoscape 3.7.2软件，R3.6.1软件等。
1.3 实验动物
雄性C57BL/6J小鼠18只，8周龄，体质量20~25 g，由北京维通利华有限公司提供，于南京中医药大学动物中心SPF级动物饲养房适应性饲养1周，温度(22±2)℃，湿度(75±5)%，清洁饮水，昼夜控制各12 h。所有动物实验设计和方案均获得南京中医药大学动物伦理委员会同意和批准(伦理批号：202005A001)。
2. 方法
2.1 桔梗水提液制备
桔梗10 g, 加水200 mL, 浸泡1 h后煎煮2 h，取药液进行减压浓缩(75 ℃)，药液体积浓缩至原有的1/3，加入95%乙醇，调节药液乙醇浓度为70%，于4 ℃冰箱内静置24 h后去除沉淀，药液在45 ℃下减压浓缩回收乙醇后，-80 ℃保存备用。
2.2 桔梗水提液化学成分分析
2.2.1 色谱条件
色谱柱：AccucoreTM C18(150 mm×2.1 mm, 2.6 μm, 美国Thermo Fisher Scientific公司)，流动相：A(0.1%甲酸水溶液)-B(0.1%甲酸乙腈溶液)，梯度洗脱条件：0~1 min，21%B；1~9 min，21%→23%B；9~15 min，23%B；15~25 min，23%→23.5%B；25~28 min，23.5%→40%B；28~29.5 min，40%→90%B; 29.5~31 min，90%B; 31~32 min，90%→21%B; 32~35 min，21%B；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：1 μL。
2.2.2 质谱条件
LTQ Orbitrap XL型串联质谱仪，采用正/负离子检测模式的ESI电离方式，m/z采集范围为120~1 600，采集时间为0~35 min。主要质谱参数：毛细管温度300 ℃，蒸发器温度300 ℃，鞘气275 kPa，辅助器104 kPa，喷雾电压3.5 kV，源电流100 μA，毛细管电压35 V，管状透镜电压100 V。
2.2.3 供试品溶液的制备
精密移取“2.1”项下桔梗水提液1 mL, 加入9 mL甲醇稀释混匀后，超声10 min, 静置过夜，隔天于18 000 r/min离心5 min, 取上清，备用。
2.2.4 桔梗水提液化学成分的表征
根据UPLC/LTQ-Orbitrap-MS分析得到桔梗提取物总离子流图。根据总离子流图所得到的化合物精确分子量、二级碎片信息，和相关文献相比对，获得主要成分信息。
2.3 网络药理学分析
2.3.1 桔梗活性成分的筛选
在TCMSP数据库中设定生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.18，对桔梗的活性成分进行筛选，结合“2.2.4”质谱分析得到的结果，确定桔梗的潜在活性成分，录入Pubchem数据库获得上述成分的SDF结构，导入Swiss Target Prediction数据库，取预测得分大于0的靶标作为药物靶点，整合去重后即得桔梗活性成分的对应靶点。
2.3.2 非酒精性脂肪肝疾病靶点的筛选
以“nonalcoholic fatty liver disease”“non-alcoholic fatty liver disease”为关键词，分别在OMIM、Disgenet、TTD数据库进行检索。
2.3.3 绘制网络图和PPI图
使用Cytoscape 3.7.2软件，构建药物-成分-靶点-疾病网络图，使用Network Analyzer功能对桔梗的主要活性成分进行分析。将上述药物-疾病共同靶点输入到String数据库中进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，构建蛋白相互作用的PPI网络。将PPI网络导入Cystoscape 3.7.2中，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，以Degree, Betweenness centrality, Average shortest path length和Closeness centrality这4个参数为参考标准，筛选出核心靶点。
2.3.4 富集分析
为了对靶基因的功能进行描述和注释，以及探究其作用的信号通路。基于R软件使用Bioconductor生物信息软件包以P < 0.05，Q < 0.05进行关键靶基因GO与KEGG功能富集分析，并将结果以气泡图形式输出。GO富集分析包括分子功能(Molecular function，MF)、生物学过程(Biological process，BP)、细胞学组分(Cellular components，CC)3个部分。进行KEGG富集分析，筛选出桔梗治疗NAFLD的潜在作用信号通路。
2.4 实验验证
2.4.1 动物实验
18只雄性C57BL/6J小鼠随机分为空白组、模型组和桔梗组，每组6只，空白组给予正常饲料，模型组给予高脂饲料，桔梗组给予高脂饲料的同时水饲桔梗水提液(合生药量4.5 g/kg)，连续喂养12周后，颈椎脱臼处死。
2.4.2 小鼠肝脏病理学观察与生化指标检测
小鼠给药12周后，颈椎脱臼处死小鼠, 迅速摘取肝脏新鲜组织，根据TG、TC试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20210612，20210611)说明书进行操作。一部分肝脏固定于4%多聚甲醛溶液中，制备石蜡切片。
2.4.3 小鼠肝脏mRNA水平
采用qPCR检测肝组织TNF、MAPK3、AKT1 mRNA的表达，以2-ΔΔCt值表示基因相对表达量。引物信息见表 1，引物由上海生工生物技术有限公司合成。
表 1 引物序列基因名 上游引物(5'→3') 下游引物(5'→3') MAPK3 CAGCTCAACCACATTCTAGGTA TCAAGAGCTTTGGAGTCAGATT AKT1 TGCACAAACGAGGGGAATATAT CGTTCCTTGTAGCCAATAAAGG TNF ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG GAPDH AGGTCGGTGTGAACGGATTTG GGGGTCGTTGATGGCAACA 2.5 统计学分析
使用GraphPad Prism软件，以x±s表示，采用单因素方差分析和多因素方差分析进行比较。P < 0.05表示差异具有统计学意义。
3. 结果
3.1 桔梗的化学成分分析及吸收预测
采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对桔梗的化学成分进行定性分析，根据化合物的一级、二级质谱信息，结合Xcalibur软件的精确相对分子质量数，对照品的标准图谱以及相关文献[10-11]，并结合Mass Frontier 7.0软件进行碎裂辅助推断和验证，对桔梗提取物图谱(图 2)中主要表征出的化学成分进行鉴定，将得到的化学成分根据Lipinski类药五原则，利用Molinspiration网站进行生物利用度预测，结果发现6个成分均可能被吸收(表 2)。桔梗的主要成分为三萜皂苷类，这些成分在正、负离子模式下均有较好响应；桔梗在正、负离子模式下色谱峰基本上是一致的，因此，本文只选择了在负离子模式下的TIC进行分析。
表 2 负离子模式下部分化合物的鉴定No. tR/min 加和离子 m/z实测值 m/z理论值 分子式 化合物名称 δ 碎片离子 1 3.04 [M-H]- 1 547.677 98 1 547.674 78 C69H112O38 桔梗皂苷E(Platycoside E) 1.356 1 457.657 48，1 005.555 79，987.701 05 2 11.73 [M-H]- 1091.528 32 1091.526 88 C52H84O24 去芹糖桔梗皂苷D(Deapio-platycodin D) 0.315 681.558 23，723.400 57，663.493 41 3 13.13 [M-H]- 1 223.569 7 1 223.569 14 C57H92O28 桔梗皂苷D(Platycodin D) 0.459 681.647 10，469.152 44，1 133.567 88 4 14.18 [M-H]- 1 265.580 04 1 265.579 7 C59H94O29 桔梗皂苷C(Platycodin C) -0.284 1 223.612 31，1 205.595 95，723.381 04 5 16.51 [M-H]- 1 237.548 58 1 237.548 4 C57H90O29 桔梗二酸A(Platycinic acid A) 0.143 1 207.483 64，1 027.451 42，485.282 23 6 19.74 [M-H]- 1 265.580 08 1 265.579 7 C59H94O29 桔梗皂苷A(Platycodin A) -0.569 1 223.518 80，1 205.570 07，723.426 82 3.2 网络药理学分析结果
3.2.1 桔梗活性成分
以OB≥30%，DL≥0.18%作为活性成分筛选条件，得到7个活性成分，再与3.1中定性分析得到的成分进行综合分析，共获得13个活性成分，分别是Dihydroquercetin、Spinasterol、Dimethy 2-O-methyl-3-O-α-D-glucopyranosyl platycogenate A、Luteolin、Acacetin、Platycodin A、2-O-Methyl-3-O-beta-D-glucopyranosyl platycogenate A、Platycodin D、Robinin、Platycodin C、Deapio-platycodin D、Platycoside E、Platycoside H/Platycinic acid A。其中OB反映药物进入人体循环的药量比例，描述口服药物由胃肠道吸收后经过肝脏到达体循环血液中的药量占口服剂量的百分比，DL指化合物与已知药物的相似性。
3.2.2 桔梗活性成分治疗NAFLD公共靶点
经过数据库筛选共获得桔梗相关靶点278个，NAFLD相关靶点1 536个，在Venny 2.1在线软件作图工具平台上输入上述靶点，绘制韦恩图，两者取交集后获得药物-疾病共同靶点83个(图 3)。
3.2.3 PPI网络的构建及核心靶点筛选
将上述药物-疾病共同靶点输入到String数据库中进行检索，设置蛋白种类为“Homo sapiens”，最低相互作用阈值为0.4，构建蛋白相互作用(PPI)网络(图 4)。
将PPI网络导入Cystoscape 3.7.2中，通过Network Analyzer工具进行拓扑分析，以Degree, Betweenness centrality, Average shortest path length和Closeness centrality这4个参数为参考标准，通过Degree排序，选取分值大于平均分的基因作为核心靶点，将前30个靶点使用R 3.6.1绘制条形图(图 5)。核心靶点信息见表 3。
表 3 核心靶点信息基因名称 蛋白名称 基因ID AKT1 RAC-alpha serine/Threonine-protein kinase P31749 MAPK3 Mitogen-activated protein kinase 3 P27361 EGFR Epidermal growth factor receptor P00533 TNF Tumor necrosis factor Tumor necrosis factor P01375 MAPK1 Mitogen-activated protein kinase 1 P20482 CASP3 Caspase-3 P42574 STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3 P40763 HSP90AA1 Heat shock protein HSP 90-alpha P07900 ESR1 Estrogen receptor P03372 MMP9 Matrix metalloproteinase-9 P14780 MTOR Serine/threonine-protein kinase mTOR P42345 IL-2 Interleukin-2 P60568 PPARG Peroxisome proliferator-activated receptor gamma P37231 MAPK14 Mitogen-activated protein kinase 14 Q16539 AR Androgen receptor P10275 PIK3CA Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate 3-kinasecatalytic subunit alpha isoform P42336 MMP2 72 kDa type Ⅳ collagenase P08253 JAK2 Tyrosine-protein kinase JAK2 O60674 CYP19A1 Aromatase P11511 APP Amyloid-beta A4 protein N-APP P12023 MPO Myeloperoxidase P05164 GSK3B Glycogen synthase kinase-3 beta P49841 MET Hepatocyte growth factor receptor P08581 MMP1 Interstitial collagenase P03956 CDK4 Cyclin-dependent kinase 4 P11802 F2 Prothrombin P00734 PLG Plasminogen P00747 AHR Aryl hydrocarbon receptor P35869 PARP1 Poly polymerase 1 P09874 PPARA Peroxisome proliferator-activated receptor alpha Q07869 3.2.4 GO富集分析
将83个共同靶点经R语言运行后GO分析选取MF、BP、CC3部分(图 6A)。GO结果显示，交集基因集合共富集到1 642条BP通路，46条CC表达过程，85个与MF相关的过程。
3.2.5 KEGG富集分析
将83个共同靶点经R语言运行后共得到141条KEGG通路，前20的结果形成KEGG功能富集的气泡图(图 6B)，P值代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。KEGG结果显示PI3K-AKT信号通路、TNF信号通路、PPAR信号通路和MAPK信号通路等与非酒精性脂肪肝关系密切。见图 7。
3.3 桔梗对NAFLD小鼠模型的影响
3.3.1 小鼠肝脏病理学观察
HE染色结果显示(图 8A)，光镜下可见空白组小鼠肝脏切片细胞形态规则，细胞质均匀，细胞核清晰，无脂肪滴；模型组肝细胞排列紊乱，细胞膨胀，部分细胞核破损，出现空泡气球样变及脂质沉积；与模型组相比，桔梗组细胞质、核清晰可见，未见空泡样变性、细胞坏死，肝细胞受损情况明显好转。
3.3.2 小鼠肝脏生化指标检测
检测小鼠肝脏中TC、TG含量(图 8B)，与空白组比较，模型组小鼠肝脏TG水平显著升高(P＜0.01);与模型组比较，桔梗组小鼠肝脏TG水平显著降低(P＜0.05)。各组小鼠肝脏中TC水平变化趋势与TG一致，但没有统计学差异(P＞0.05)。
3.3.3 小鼠肝脏中靶基因表达
通过qPCR检测网络药理学富集分析结果中通路关键靶点基因表达情况，选取排名靠前的3个靶基因进行实验。与空白组相比，模型组小鼠肝脏MAPK3和AKT1 mRNA表达水平显著上升(P＜0.01);与模型组相比，桔梗组小鼠肝脏MAPK3和AKT1 mRNA表达水平显著下降(P＜0.05)。小鼠肝脏中TNF mRNA表达水平变化趋势与MAPK3和AKT1 mRNA一致，但差异无统计学意义(P＞0.05)。见图 9。
4. 讨论
NAFLD是肝功能异常和慢性肝病最常见的原因，成人NAFLD患病率约为20%~33%。随着全球肥胖症和代谢综合征人数日益增长，亚洲国家近20年来NAFLD增长迅速且呈低龄化发病趋势[12-14]。研究表明，到2030年，中国NAFLD患者总数将增至3.145 8亿，是全球患病率增长最快的国家[15]，这必将给我国健康医疗服务带来沉重负担。遗憾的是，现代医学目前对NAFLD的治疗尚无特效药物[16]。
研究发现药食同源的桔梗对多种药物性肝损伤模型都有治疗作用[17]。桔梗水煎液可以抑制四氯化碳导致的肝脏毒性，其机制与清除氧自由基相关[18]；水煎液还能减轻四氯化碳诱导的肝纤维化，其机制主要是激活肝星状细胞[19]；桔梗根部分离的皂苷可以保护由过氧化叔丁醇造成的肝毒性，与其清除氧自由基和保护细胞免受氧化应激反应有关[20]；桔梗水提物能保护由乙酰氨基酚引起的肝损伤，与阻断肝药酶对乙酰氨基酚的生物激活相关[21]。
本文采用UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对桔梗水提物的主要成分进行分析，主要表征出6个三萜皂苷类化学成分。再结合TCMSP数据库中活性成分共获得13个活性成分进行分析。通过活性成分-靶点-通路关系网络的搭建、拓扑参数的分析及生物通路的信息挖掘对桔梗抗NAFLD的化学成分、潜在作用靶点及其分子机制进行富集分析。结果显示PI3K-AKT、AGE-RAGE、丙型肝炎、催乳素、雌激素、EGFR、细胞凋亡、胰岛素抵抗、TNF-α、IL-17、JAK-STAT、T细胞受体等可能为桔梗抗NAFLD的潜在作用机制。
本研究基于拓扑参数分析发现桔梗皂苷D(Platycodin D)、木犀草素(Luteolin)、金合欢素(Acacetin)、二氢槲皮素(Dihydroquercetin)等可能为桔梗水提物治疗NAFLD的重要活性成分。桔梗皂苷D通过激活SIRT1和CaMKKβ/AMPK信号通路，抑制SREBP-1c的表达来抑制脂肪的生成[22]。木犀草素能通过抑制JNK磷酸化，降低肝细胞氧化应激，保护线粒体功能，抵抗DNA断裂诱发细胞凋亡，从而达到保护过量对乙酰氨基酚导致的肝细胞损伤以及高脂饲料诱导的肝脏脂肪变性[23-24]。金合欢素能明显上调肝细胞和肝组织中转录因子SREBP-2的蛋白水平，改善肝细胞脂质代谢[25]。此外，金合欢素还可以增强大鼠肝组织匀浆和血浆中谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶的活性，可以显著清除DPPH自由基，有效减弱体外的脂质过氧化反应，从而达到治疗肝损伤的目的[26]。二氢槲皮素可以通过抑制Caspase-3、Caspase-7和Caspase-8的活化来保护HepG2细胞免受TNF-ot/ActD诱导的细胞凋亡[27]；可以通过调节酶活和减少活性氧的积累来改善机体氧化，激活LKBl基因的表达，增强AMPK磷酸化来调节胆固醇调节元件结合蛋白SREBPl和ACC的表达[28]；还可以上调SIRTl(负责去乙酰化)的表达，下调P2X7R(负责促炎因子的合成与释放)和NLRP3等转录因子的表达，从而起到抑制脂肪生成和保肝的功效[29]。
NAFLD发病机制非常复杂，其进展可能涉及“平行多次打击”损伤的发生，其特征是氧化应激诱导的线粒体功能障碍，目前认为高脂饮食、胰岛素抵抗、氧化应激、炎症介质和细胞因子是重要诱因[30-31]。其中胰岛素是调控机体内部糖与脂类代谢的重要激素，胰岛素抵抗被认为是发生NAFLD和代谢综合征的中心环节[32]。
富集分析发现PI3K/AKT是桔梗抗NAFLD最相关的信号通路。确实，PI3K/AKT作为传递胰岛素信号的关键通路，通过调控胰岛素水平参与体内的糖脂代谢。而各种因素导致的PI3K/AKT信号传导障碍，均可引起胰岛素抵抗，从而促进NAFLD的发生与发展[33]。研究资料表明[34]，人体内的胰岛素主要通过PI3K-AKT信号通路来维持糖脂代谢的平衡。胰岛素是在胰岛β细胞刺激下分泌的一种激素，它能调控机体内的糖脂代谢，从而维持平衡。机体内的胰岛素到达作用的组织器官后，首先与胰岛素受体(InsR)的α亚基结合，诱导β亚基的酪氨酸蛋白激酶(PTK)被激活，随后PTK又使InsR的底物磷酸化，继而活化它的催化亚基p110，随后生成PIP3，与PDK1结合并激活3种已知的AKT异构体，AKT被激活后从质膜上释放出来，转移到胞核、胞质和线粒体中[35]。
综上所述，本研究基于UPLC/LTQ-Orbitrap-MS技术对桔梗水提物中化学成分进行鉴定，结合网络药理学方法预测桔梗治疗NAFLD的主要化学成分和潜在作用机制，充分体现了桔梗多成分、多靶点、多通路的系统调控特点；同时通过体内实验对网络药理学富集分析得到的排名前3的关键靶基因TNF、MAPK3、AKT1做了初步验证，为进一步探讨桔梗治疗NAFLD的物质基础和作用机制提供一定参考依据。
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表 1 引物序列
基因名 上游引物(5'→3') 下游引物(5'→3') MAPK3 CAGCTCAACCACATTCTAGGTA TCAAGAGCTTTGGAGTCAGATT AKT1 TGCACAAACGAGGGGAATATAT CGTTCCTTGTAGCCAATAAAGG TNF ATGTCTCAGCCTCTTCTCATTC CGATCACCCCGAAGTTCAGTAG GAPDH AGGTCGGTGTGAACGGATTTG GGGGTCGTTGATGGCAACA 
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表 2 负离子模式下部分化合物的鉴定
No. tR/min 加和离子 m/z实测值 m/z理论值 分子式 化合物名称 δ 碎片离子 1 3.04 [M-H]- 1 547.677 98 1 547.674 78 C69H112O38 桔梗皂苷E(Platycoside E) 1.356 1 457.657 48，1 005.555 79，987.701 05 2 11.73 [M-H]- 1091.528 32 1091.526 88 C52H84O24 去芹糖桔梗皂苷D(Deapio-platycodin D) 0.315 681.558 23，723.400 57，663.493 41 3 13.13 [M-H]- 1 223.569 7 1 223.569 14 C57H92O28 桔梗皂苷D(Platycodin D) 0.459 681.647 10，469.152 44，1 133.567 88 4 14.18 [M-H]- 1 265.580 04 1 265.579 7 C59H94O29 桔梗皂苷C(Platycodin C) -0.284 1 223.612 31，1 205.595 95，723.381 04 5 16.51 [M-H]- 1 237.548 58 1 237.548 4 C57H90O29 桔梗二酸A(Platycinic acid A) 0.143 1 207.483 64，1 027.451 42，485.282 23 6 19.74 [M-H]- 1 265.580 08 1 265.579 7 C59H94O29 桔梗皂苷A(Platycodin A) -0.569 1 223.518 80，1 205.570 07，723.426 82
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表 3 核心靶点信息
基因名称 蛋白名称 基因ID AKT1 RAC-alpha serine/Threonine-protein kinase P31749 MAPK3 Mitogen-activated protein kinase 3 P27361 EGFR Epidermal growth factor receptor P00533 TNF Tumor necrosis factor Tumor necrosis factor P01375 MAPK1 Mitogen-activated protein kinase 1 P20482 CASP3 Caspase-3 P42574 STAT3 Signal transducer and activator of transcription 3 P40763 HSP90AA1 Heat shock protein HSP 90-alpha P07900 ESR1 Estrogen receptor P03372 MMP9 Matrix metalloproteinase-9 P14780 MTOR Serine/threonine-protein kinase mTOR P42345 IL-2 Interleukin-2 P60568 PPARG Peroxisome proliferator-activated receptor gamma P37231 MAPK14 Mitogen-activated protein kinase 14 Q16539 AR Androgen receptor P10275 PIK3CA Phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate 3-kinasecatalytic subunit alpha isoform P42336 MMP2 72 kDa type Ⅳ collagenase P08253 JAK2 Tyrosine-protein kinase JAK2 O60674 CYP19A1 Aromatase P11511 APP Amyloid-beta A4 protein N-APP P12023 MPO Myeloperoxidase P05164 GSK3B Glycogen synthase kinase-3 beta P49841 MET Hepatocyte growth factor receptor P08581 MMP1 Interstitial collagenase P03956 CDK4 Cyclin-dependent kinase 4 P11802 F2 Prothrombin P00734 PLG Plasminogen P00747 AHR Aryl hydrocarbon receptor P35869 PARP1 Poly polymerase 1 P09874 PPARA Peroxisome proliferator-activated receptor alpha Q07869
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期刊类型引用(1)
1. 刘静，龙凯花，马战平，杜霞，张红. 基于UHPLC-Q Exactive Focus MS/MS的益肺解毒颗粒化学成分分析. 中国药学杂志. 2023(21): 1940-1954 . 
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