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AS-PCR法鉴别炮制辅料鳖血和常见掺伪品的研究

苏雪蓉 谢颖 娄悦 苏联麟 毛春芹 赵晓莉 陆兔林

苏雪蓉, 谢颖, 娄悦, 苏联麟, 毛春芹, 赵晓莉, 陆兔林. AS-PCR法鉴别炮制辅料鳖血和常见掺伪品的研究[J]. 南京中医药大学学报, 2022, 38(10): 953-960. doi: 10.14148/j.issn.1672-0482.2022.0953
引用本文: 苏雪蓉, 谢颖, 娄悦, 苏联麟, 毛春芹, 赵晓莉, 陆兔林. AS-PCR法鉴别炮制辅料鳖血和常见掺伪品的研究[J]. 南京中医药大学学报, 2022, 38(10): 953-960. doi: 10.14148/j.issn.1672-0482.2022.0953
SU Xue-rong, XIE Ying, LOU Yue, SU Lian-lin, MAO Chun-qin, ZHAO Xiao-li, LU Tu-lin. Identification of Processing Adjuvant Trionyx Sinensis Blood and Common Adulterants by AS-PCR[J]. Journal of Nanjing University of traditional Chinese Medicine, 2022, 38(10): 953-960. doi: 10.14148/j.issn.1672-0482.2022.0953
Citation: SU Xue-rong, XIE Ying, LOU Yue, SU Lian-lin, MAO Chun-qin, ZHAO Xiao-li, LU Tu-lin. Identification of Processing Adjuvant Trionyx Sinensis Blood and Common Adulterants by AS-PCR[J]. Journal of Nanjing University of traditional Chinese Medicine, 2022, 38(10): 953-960. doi: 10.14148/j.issn.1672-0482.2022.0953

AS-PCR法鉴别炮制辅料鳖血和常见掺伪品的研究

doi: 10.14148/j.issn.1672-0482.2022.0953
基金项目: 

国家重点研发计划 2018YFC1707000

详细信息
    作者简介:

    苏雪蓉, 女, 硕士研究生, E-mail: suxuer69@163.com

    陆兔林, 教授,博士生导师。国家教育部中药炮制工程中心主任,国家重点研发计划首席专家,国家药典委员会饮片标准专家,国家中药标准化指导组专家,国家科技部科技成果评审专家; 国家教育部《中药炮制学》一流课程负责人、全国高等学校中药资源及中药制药专业建设指导委员会委员; 中国中药协会中药饮片专委会副主任、经典名方专委会副主任; 江苏省、江西省优秀科技创新团队负责人; 南京中医药大学中药炮制与制剂系主任等。主要从事中药质量及饮片炮制研究,主持国家重点研发计划、行业重大专项、科技支撑计划及国家自然科学基金等20余项,《中国药典》标准25项,新药项目15项; 主编或副主编教材专著20余部, 发表论文460佘篇, SCI源60余篇, 获省部级科技奖7项,获授权专利18项

    通讯作者:

    赵晓莉, 女, 副研究员, 主要从事中药药剂学研究, E-mail: xlee_zhao@njucm.edu.cn

    陆兔林, 男, 教授, 博士生导师, 主要从事中药炮制学研究, E-mail: ltl2021@njucm.edu.cn

  • 中图分类号: R284

Identification of Processing Adjuvant Trionyx Sinensis Blood and Common Adulterants by AS-PCR

  • 摘要:   目的  建立一种炮制辅料鳖血等位基因特异性PCR(AS-PCR)鉴别方法, 快速、准确地鉴别鳖血与其它常见动物血液。  方法  通过比较鳖血基原中华鳖和驴、牛、羊、鸡、猪、兔为代表的常见动物的CO Ⅰ序列差异, 根据SNP位点设计鳖血特异性鉴别引物, 优化PCR反应体系, 并进行耐受性、适用性、掺伪灵敏度考察验证。  结果  实验条件为退火温度62 ℃、循环次数29次、引物用量0.2 μL、DNA模板浓度100 ng时, 鳖血使用设计的ZHB286引物经PCR扩增和凝胶电泳后出现约286 bp的明亮条带, 其他动物血液样品均无条带出现。  结论  该AS-PCR鉴别方法具有高度特异性, 能准确鉴别鳖血和其他常见动物血液, 进而可用于鳖血与驴、牛、羊、鸡、猪、兔血掺伪鉴别, 在血液类药材分子鉴定中具有广泛应用价值。

     

  • 图  1  鳖血通用引物扩增

    注: M.DL 5000 DNA Marker Ⅱ; 1~4.鳖血(BY1~BY4)

    Figure  1.  Amplification of general primers for Trionyx sinensis blood

    图  2  鳖血特异性引物扩增

    注: M.Trans DNA Marker Ⅱ; 1.鳖血(BY1);2.驴血(LX1);3.牛血(NX1);4.鸡血(JX1); 5.羊血(YX1);6.猪血(ZX1);7.兔血(TX1);8.阴性对照

    Figure  2.  Amplification of specific primers for Trionyx sinensis blood

    图  3  鳖血AS-PCR反应条件考察

    注: M.Trans DNA Marker Ⅱ; 1.鳖血(BY1);2.驴血(LX1);3.牛血(NX1);4.鸡血(JX1); 5.羊血(YX1);6.猪血(ZX1);7.兔血(TX1);8.阴性对照

    Figure  3.  Identification conditions of excipient Trionyx sinensis blood by Specific PCR

    图  4  不同产地的鳖血PCR扩增

    注: M.Trans DNA Marker Ⅱ; N.阴性对照; 1~12.12批不同产地鳖血(BY2~BY4、HZ1~HZ3、HS1~HS3、YY1~YY3)

    Figure  4.  PCR amplification of Trionyx sinensis blood from different habitats

    图  5  鳖血与其他动物血液样品PCR扩增

    注: M.Trans DNA Marker Ⅱ; N.阴性对照; 1.鳖血(BY1);2.驴血(LX1);3.牛血(NX1);4.鸡血(JX1);5.羊血(YX1);6.猪血(ZX1); 7.兔血(TX1)

    Figure  5.  PCR amplification of Trionyx sinensis blood and other animal blood samples

    图  6  鳖血样品PCR扩增

    注: M.Trans DNA Marker Ⅱ; 1~7.鳖血样品模板DNA分别与中华鳖、驴、牛、鸡、羊、猪、兔引物反应谱带; 8~14.阴性对照(加与模板等量的DEPC水)

    Figure  6.  PCR amplification of Trionyx sinensis blood samples

    图  7  鳖血掺入不同比例牛血PCR扩增

    注: M.Trans DNA Marker Ⅱ; N.阴性对照; 1~7.鳖血BY4(掺有100%、80%、50%、20%、10%、5%牛血及不掺牛血)

    Figure  7.  PCR amplification of Trionyx sinensis blood mixed with different proportions of bovine blood

    图  8  鳖血等比掺伪其他动物血液样品PCR扩增

    注: M.Trans DNA Marker Ⅱ; N.阴性对照; 1~7.鳖血BY4与等比掺伪驴血、牛血、鸡血、羊血、猪血、兔血混合样品DNA与各自引物反应谱带

    Figure  8.  PCR amplification of Trionyx sinensis blood samples adulterated with other animals blood

    表  1  样品来源信息

    Table  1.   Sample source information

    名称 收集地 批数 编号
    鳖血 江苏宝应 4 BY1~4
    鳖血 湖南汉寿 3 HS1~3
    鳖血 浙江淳安 3 HZ1~3
    鳖血 浙江余姚 3 YY1~3
    驴血 江苏新沂 1 LX1
    牛血 江苏新沂 1 NX1
    鸡血 江苏新沂 1 JX1
    羊血 江苏新沂 1 YX1
    猪血 江苏新沂 1 ZX1
    兔血 江苏南京 1 TX1
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    表  2  引物参数

    Table  2.   Primer parameters

    引物名称 引物类型 序列(5'→3')
    HCO2198 通用引物 GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG
    LCO1490 通用引物 TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA
    ZHB286.F 鉴别引物 CTAGCAACCTAGCCCATGTG
    ZHB286.R 鉴别引物 GGATCTCCTCCTCCAGAAGG
    ZHB1.F 鉴别引物 ACTTCTCCTAGCATCATCAGGC
    ZHB1.R 鉴别引物 CTGCGGCTAACACTGGTAGT
    ZHB2.F 鉴别引物 ACTTCTCCTAGCATCATCAGCC
    ZHB2.R 鉴别引物 CTGCGGCTAACACTGGTAGT
    ZHB3.F 鉴别引物 TTCTCCTAGCATCATCCGCC
    ZHB3.R 鉴别引物 CTGCGGCTAACACTGGTAGT
    LvXue.F 鉴别引物 CAAGCTCAACGTCACACATATC
    LvXue.R 鉴别引物 CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC
    NiuXue.F 鉴别引物 CCTGTGTTGGGTTAACAATAGTC
    NiuXue.R 鉴别引物 CCGATGGTGATATATGGGTGTT
    YangXue.F 鉴别引物 GGCGCCATGCTACTAATTCTTGTT
    YangXue.R 鉴别引物 GAGGAAGGGTACAAGTACTAAGAT
    JiXue.F 鉴别引物 CCATCTTAGCCTCAACGATTAA
    JiXue.R 鉴别引物 GGCTATTGAGCTCACTGTTGTT
    ZhuXue.F 鉴别引物 GCACACCTATAACGGTAGCTCAT
    ZhuXue.R 鉴别引物 TCCTAGCTATCGTGTGTCAGGAT
    TuXue.F 鉴别引物 CGGCGTAAAGCGTGATTAGAATAA
    TuXue.R 鉴别引物 GCTATCGTGAGTTCGAAGAGTAT
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2022-03-23
  • 网络出版日期:  2022-10-25
  • 发布日期:  2022-10-10

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