摘要:
目的 探讨温肾通络止痛方调控巨噬细胞衰老对老年性骨质疏松症(Senile osteoporosis, SOP)的干预作用。 方法 利用过氧化氢制备衰老巨噬细胞模型并随机分为对照组、模型组、含药血清低剂量组、含药血清高剂量组。β-半乳糖苷酶染色以及qPCR、Western blot检测衰老指标p21和p53的mRNA及蛋白表达水平, 探讨含药血清对巨噬细胞衰老的影响。使用活性氧(Reactive oxygen species, ROS)染色和线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测巨噬细胞线粒体功能。qPCR检测巨噬细胞极化相关分子白细胞介素-6(Interleukin-6, IL-6)、白细胞介素-10(Interleukin-10, IL-10)、CD206、一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase, iNOS)的mRNA水平, 免疫荧光检测巨噬细胞极化相关分子精氨酸酶(Arginase, ARG1)和iNOS的蛋白表达, 评估含药血清对巨噬细胞极化的影响。qPCR检测成骨相关指标骨钙蛋白(Osteocalcin, OCN)、Ⅰ型胶原蛋白(Collagen type Ⅰ α 1, Col1a1)、Runt相关转录因子2(Runt-related transcription factor 2, Runx2)的mRNA水平以及ALP染色和茜素红染色, 评估含药血清处理的巨噬细胞条件培养基对骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)成骨分化的影响。将C57BL/6J小鼠随机分为对照组、模型组、温肾通络止痛方低剂量组、温肾通络止痛方高剂量组, D-半乳糖制备SOP小鼠模型。Micro-CT分析小鼠股骨微结构, HE染色检测小鼠股骨病理变化, Western blot检测小鼠胫骨衰老相关分子p21、p53和成骨相关指标OCN、Runx2蛋白表达水平, qPCR检测小鼠胫骨衰老相关分子p21、p53 mRNA和巨噬细胞极化相关分子IL-6、iNOS、CD206、IL-10 mRNA的表达水平, 评估温肾通络止痛方对小鼠SOP模型的影响。 结果 与模型组相比, 温肾通络止痛方含药血清干预后, 衰老阳性细胞数量明显减少, p21和p53 mRNA和蛋白表达均显著降低(P＜0.05, P＜0.01, P＜0.001)。此外, 含药血清可显著抑制H2O2诱导的巨噬细胞ROS的产生(P＜0.05, P＜0.001)、线粒体膜电位下降(P＜0.05)。含药血清处理后, 巨噬细胞M1相关基因iNOS的mRNA表达下调(P＜0.01), M2相关基因CD163和CD206 mRNA表达上调(P＜0.05), iNOS荧光强度显著降低(P＜0.01), ARG1的荧光强度显著增加(P＜0.05)。含药血清处理的巨噬细胞条件培养基可增加ALP阳性细胞数(P＜0.01, P＜0.001)、茜素红阳性面积(P＜0.05), 以及升高成骨相关基因Runx2、Col1a1和OCN mRNA表达(P＜0.05, P＜0.01)。Micro-CT结果显示, 与模型组相比, 温肾通络止痛方组小鼠股骨BMD、BV/TV、Tb.N显著增加(P＜0.05, P＜0.01, P＜0.001), Tb.Sp显著降低(P＜0.05, P＜0.01);HE结果显示, 骨小梁明显改善, 数量增多变宽。此外, 温肾通络止痛方可显著抑制D-半乳糖诱导的小鼠胫骨衰老相关基因p21和p53 mRNA和蛋白上调(P＜0.05, P＜0.001, P＜0.000 1), 促进成骨相关指标OCN、Runx2蛋白表达(P＜0.01, P＜0.000 1), 促进M1相关基因IL-6和iNOS下调(P＜0.05), 同时可促进M2相关基因IL-10和CD206表达(P＜0.05, P＜0.01)。 结论 温肾通络止痛方可能通过抑制巨噬细胞衰老, 促进BMSC成骨分化, 从而发挥抗骨质疏松效应。
