Research on Water Extraction Process of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae Based on Network Pharmacology and Design Space
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摘要:目的 优选金银花-连翘药对水提取工艺。方法 借助网络药理学对金银花-连翘潜在的活性成分进行初步筛选, 再结合《中国药典》2020年版一部金银花、连翘项下规定的质量标志物及参考文献确定指标性成分, 同时以金银花-连翘药对的出膏率及指标性成分的提取率作为水提取工艺的关键质量属性(Critical quality attributes, CQAs), 筛选关键工艺参数(Critical process parameters, CPPs), 通过Box-Behnken设计建立数学模型, 考察CQAs和CPPs之间的交互作用, 构建金银花-连翘水提取工艺的设计空间。结果 筛选出酚酸类、连翘酯苷A和连翘苷作为金银花-连翘药对的指标成分, 饮片规格、提取时间、提取加水量为关键工艺参数。基于设计空间确定的最佳水提取工艺参数为: 连翘饮片规格0.8~1.2 cm, 一煎加12倍量水, 提取30~50 min, 二煎加10倍量水, 提取25~30 min。结论 运用设计空间验证提取工艺所得的实测值与预测值基本一致, 表明建立的方法稳定可靠, 为金银花-连翘药对的工艺开发及质量控制提供思路。Abstract:OBJECTIVE To optimize the water extraction process of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae and determine the range of water extraction process parameters.METHODS The active components were screened by network pharmacology, and the indicator ingredients were determined in combination with the quality markers under the relevant terms of Chinese Pharmacopoeia 2020 edition and the literature. Take extraction yield and the extraction rate of the indicative component as the critical quality attributes of the water extraction process to screen critical process parameters. The mathematical model was established by Box-Behnken experimental design to investigate the interaction between CQAs and CPPs and build the design space of the water extraction process of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae.RESULTS The extraction percentages of phenolic acids, forsythoside A and forsythin were screened as the index components; specifications of medicinal slices, extraction time and water addition were the key process parameters. Based on the establishment and optimization of the design space, the optimum water extraction process was obtained as follows: the medicinal slice of Lian-Qiao was broken into 0.8-1.2 cm, adding 12 times the amount of water in the first and extract for 30-50 min, 10 times the amount of water in the second and extract for 25-30 min.CONCLUSION The verification results show that the measured value obtained by using the design space method to optimize the water extraction process is close to the predicted value, indicating that the method is stable and reliable, which can provide ideas for its further process development and quality control for the couple medicines of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae.
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中药药对是经过历代医家反复实践提炼, 符合中医药对七情配伍理论, 临床发挥协同、抑制或新生功用, 且已形成相对固定形式, 经常配伍使用的两味药物[1]。金银花、连翘配伍使用, 代表性方剂为吴鞠通《温病条辨》所载的银翘散。金银花味苦性微寒, 入肺、心、胃经, 具有清热解毒、疏散风热的功效; 连翘味苦、微寒, 入肺、心、小肠经, 具有清热解毒、疏散风热的功效, 二者相须为用, 既可用于外感温热而解表, 又可用于泻里热而解毒[2]。现代药理研究表明, 金银花-连翘药对具有较好的抗病毒、抗菌及解热抗炎作用, 且按1 ∶ 1配伍使用, 解热作用最明显[3-5]。网络药理学是一门新兴的学科, 是在系统生物学与计算机技术高速发展的背景下发展起来的, 通过揭示中药化合物的作用和治疗机制来研究药物、靶点和疾病之间的关系, 阐明中药对疾病的作用机制[6-7]。网络药理学的系统性质与中医的整体观念基本一致, 为中药药效物质基础及作用机制研究提供了一种新的思路, 在一定程度上反映了中药研究的趋势[8]。
质量源于设计(Quality by design, QbD)是通过实验设计来评价关键质量属性(Critical quality attributes, CQAs)和关键工艺参数(Critical process parameters, CPPs)之间的关系模型[9]。QbD的理念运用于中药制剂的生产, 可找出对工艺参数产生影响的物料属性和工艺参数, 建立控制策略, 为关键物料属性和关键工艺参数建立可接受的范围而不是固定值。徐冰等[10]提出中药制剂生产工艺中建立设计空间的设想, 认为设计空间法建立的设计空间可以使中药生产工艺参数在一定范围内波动, 当药品生产工艺参数在设计空间内时则无需申报, 可提高药品监管的灵活性, 节约人力、物力及财力。本研究借助网络药理学并结合《中国药典》2020年版及文献报道对金银花-连翘药对活性成分进行筛选得到指标成分群, 采用设计空间法优选金银花-连翘药对水提取工艺, 以期为金银花-连翘药对的工业化生产提供理论指导与技术支持。
1. 材料
1.1 仪器
Waters Arc型高效液相色谱仪(Waters公司); XP26型百万分之一电子天平(Mettler Toledo公司); 实验室Milli-Q超纯水系统(默克股份有限公司); JJ2000B百分之一电子天平(常熟市双杰测试仪器厂); ME203E千分之一电子天平(Mettler Toledo公司); ME204E万分之一电子天平(Mettler Toledo公司); KQ-500DE数控超声机清洗器(昆山市超声仪器有限公司); DHG-9147A型电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。
1.2 试药
金银花(批号: YM2104006)购自山东中平药业有限公司; 连翘(批号: YC2106018)购自哈尔滨福顺堂药材有限公司, 经广东一方制药有限公司孙冬梅主任中药师鉴定, 金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾, 连翘为木犀科植物连翘Forsythia suspensa (Thunb.) Vahl的干燥果实, 且为青翘。新绿原酸(批号: DSTDX001503, 纯度: 99.58%)、隐绿原酸(批号: DST210427-035, 纯度: 98.24%)对照品均购自成都德思特生物技术有限公司; 绿原酸(批号: 110753-202018, 纯度: 96.1%)、咖啡酸(批号: 110885-201703, 纯度: 99.7%)、4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸(批号: 111894-202104, 纯度: 95.1%)、连翘苷(批号: 110821-202117, 纯度: 94.9%)、连翘酯苷A(批号: 111810-201707, 纯度97.2%)对照品均购自中国食品药品检定研究院; 甲醇(分析纯, 西陇科学股份有限公司); 甲醇、乙腈(色谱纯, 默克股份有限公司); 磷酸(色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司); 水为超纯水(实验室Milli-Q超纯水系统, 默克股份有限公司)。
2. 方法与结果
2.1 金银花-连翘药对网络药理学研究
2.1.1 金银花-连翘药对活性成分收集与筛选
利用中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform, TCMSP), 通过设定口服生物利用度(Oral bioavailability, OB≥30%)和类药性(Drug-likeness, DL≥0.18)阈值来筛选金银花、连翘的活性成分, 同时为避免将金银花、连翘潜在抗病毒的有效成分筛除, 还参考金银花、连翘在《中国药典》(2020年版)中规定的质量标志物及文献调研等, 对有明确药理活性的成分进行整理、分析, 从而得到金银花-连翘药对主要活性成分集[11-14], 成分合集见表 1。
表 1 金银花-连翘药对主要活性成分基本信息Table 1. The key active components of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae组分 MOL ID 化合物 Pubchem CID OB/% DL/% 金银花 MOL000449 豆甾醇 5280794 43.83 0.76 MOL001494 Mandenol 5282184 42.00 0.19 MOL001495 亚麻酸乙酯 6371716 46.10 0.20 MOL002773 β-叶红素 5280489 37.18 0.58 MOL002914 Eriodyctiol(flavanone) 373261 41.35 0.24 MOL003006 (-)-(3R, 8S, 9R, 9aS, 10aS)-9-ethenyl-8-(beta-D-glucopyranosyloxy)-2, 3, 9, 9a, 10, 10a-hexahydro-5-oxo-5H, 8H-pyrano[4, 3-d]oxazolo[3, 2-a]pyridine-3-carboxylic acid_qt / 87.47 0.23 MOL003014 Secologanic dibutylacetal_qt / 53.65 0.29 MOL003036 ZINC03978781 11870462 43.83 0.76 MOL003044 Chryseriol 5280666 35.85 0.27 MOL003095 5-羟基-7-甲氧基-2-(3, 4, 5-三甲氧苯基)色酮 10970376 51.96 0.41 MOL003111 Centauroside_qt / 55.79 0.50 MOL003117 Ioniceracetalides B_qt / 61.19 0.19 MOL003128 Dinethylsecologanoside / 48.46 0.48 连翘 MOL000173 Wogonin 5281703 30.68 0.23 MOL000211 Mairin 64971 55.38 0.78 MOL000522 牛蒡子苷 100528 69.67 0.88 MOL000791 荷包牡丹碱 10237 81.25 0.57 MOL003283 (2R, 3R, 4S)-4-(4-Hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-methoxy-2, 3-dimethylol-tetralin-6-ol 160521 66.51 0.39 MOL003290 (3R, 4R)-3, 4-Bis[(3, 4-dimethoxyphenyl)methyl]oxolan-2-one 384877 52.30 0.48 MOL003295 (+)-松脂酚单甲基醚 / 53.08 0.57 MOL003305 连翘苷 24721571 36.40 0.86 MOL003306 ACon1_001697 21722915 85.12 0.57 MOL003308 (+)-松脂酚单甲基醚-4-D-β-葡萄糖苷 / 61.20 0.57 MOL003315 3Beta-acetyl-20, 25-epoxydammarane-24alpha-ol / 33.07 0.79 MOL003322 连翘酯醇 / 95.04 0.57 MOL003330 (-)-连翘脂素 3083590 42.06 0.74 MOL003347 Hyperforin 441298 44.03 0.61 MOL003370 Onjixanthone Ⅰ 5320290 34.45 0.84 共有及其它活性成分 MOL000006 木犀草素 5280445 36.16 0.25 MOL000098 槲皮素 5280343 46.43 0.28 MOL000358 β-谷甾醇 222284 36.91 0.75 MOL000414 咖啡酸 1549111 54.97 0.05 MOL000415 芦丁 5280805 3.20 0.68 MOL000422 山柰酚 5280863 41.88 0.24 MOL003065 隐绿原酸 9798666 10.48 0.33 MOL003066 新绿原酸 5280633 10.65 0.33 MOL003068 4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸 6474309 1.73 0.69 MOL003331 连翘酯苷A 5281773 3.05 0.61 MOL003871 绿原酸 1794427 13.61 0.31 2.1.2 活性化合物靶标蛋白、疾病基因靶点的筛选及韦恩图构建
利用TCMSP数据库中的靶点预测功能收集金银花-连翘药对活性成分的靶标蛋白, 借助UniProt数据库, 导入蛋白名称及设定物种为人, 将检索得到的蛋白靶标校正为UniProt ID并得到靶标蛋白对应的基因名。以“Respiratory tract infection(RTI, 呼吸道感染)”为关键词, 分别在GengCards数据库、OMIM数据库进行搜索, 合并除去重复值, 得到RTI相关疾病靶点, 根据“Relevance score”, 以中位数法选取得到2 551个基因靶点。将上述疾病靶点与成分靶点取交集, 构建韦恩图, 筛选二者共同靶点, 则为药对活性成分治疗呼吸道感染的潜在靶点, 韦恩图结果见图 1。
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图 1 金银花-连翘药对成分靶点与疾病靶点韦恩图Figure 1. Venn diagram of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae components genes and disease genes2.1.3 靶点通路分析
将靶点导入DAVID数据库进行基因本体(Gene ontology, GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)通路富集分析, 以P < 0.05为筛选条件, 得到GO条目555个, 其中生物过程(BP)条目439个, 细胞组成(CC)条目46个, 分子功能(MF)条目70个, 分别占79.1%、8.3%、12.6%。KEGG通路富集分析筛选得到144条信号通路, 分别选P值最小的前20个富集结果进行可视化分析, 见图 2~3。GO-BP分析筛选的前20条富集结果主要涉及基因表达的正向调控、凋亡过程的负向调控等; GO-CC分析筛选前20富集结果主要涉及细胞核、细胞质等; GO-MF分析筛选前20条富集结果主要涉及肽酶活性、蛋白同源二聚体活性、细胞因子活性等。KEGG分析筛选前20条富集结果涉及IL-17信号通路、TNF信号通路、PI3K-Akt信号通路等, 主要与病毒感染、炎症反应、机体免疫等相关[15]。
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图 2 金银花-连翘药对成分作用靶点GO功能分析Figure 2. Analysis of GO function of ingredient action targets of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae![]()
图 3 金银花-连翘药对成分作用靶点KEGG通路富集分析的20条通路气泡图Figure 3. 20-Channel bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae2.1.4 药物-成分-靶通路相互作用网络图的构建
将得到的交集基因导入Cytoscape3.7.2软件, 设置“度值(Degree)、中介值(Betweenness)、紧密值(Closeness)”3个参数均大于中位数的点作为主要成分和核心靶点, 构建药物-成分-靶点-通路相互作用网络图。该药物-成分-靶点-通路相互作用网络共108个节点(包括1个药物、31个活性成分、56个靶点、20条通路)和696条边, 见图 4。根据网络拓扑参数分析可知, 连接化合物或靶点较多的节点在整个网络中起到枢纽作用, 可能是关键的化合物或靶点, 且存在一个成分连接多个靶点、多种成分作用到同一个靶点上、一个靶点与多个通路、多个靶点与一个通路相互作用等, 这体现了中药多成分与多靶点、多通路相互作用的整体性与联系性[16]。基于上述网络拓扑分析活性成分度值排名初步筛选得到的关键化合物、结合文献中有关抗菌抗病毒成分的报道及《中国药典》2020年版一部中对金银花、连翘药材指标性成分规定和预实验分析结果, 最终确定酚酸类成分、连翘酯苷A、连翘苷为金银花-连翘药对提取工艺研究质量控制的活性成分群。
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图 4 金银花-连翘药对药物-成分-靶点-通路相互作用网络图注: 红色圆点代表药物; 绿色八边形代表成分; 紫色菱形代表靶点; 黄色三角形代表通路。Figure 4. The interaction network diagram of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae drug-component-target-pathway2.2 活性成分群含量测定方法的建立
2.2.1 色谱条件
色谱柱: Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm); 流动相: 乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B), 梯度洗脱(0~5 min, 10%A; 5~10 min, 10%~15%A; 10~30 min, 15%~18%A; 30~40 min, 18%~44%A; 40~45 min, 44%~10%A); 流速: 0.8 mL·min-1; 检测波长: 280 nm; 进样量: 10 μL; 柱温: 40 ℃。
2.2.2 对照品溶液的制备
精密称取新绿原酸对照品、绿原酸对照品、隐绿原酸对照品、咖啡酸对照品、4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸对照品适量, 加甲醇制成每1 mL含新绿原酸76.776 2 μg、绿原酸826.940 5 μg、隐绿原酸123.727 8 μg、咖啡酸49.949 7 μg、4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸156.059 1 μg的混合对照品溶液。另精密称取连翘酯苷A、连翘苷对照品适量, 分别加甲醇制成每1 mL含连翘酯苷A 1 058.584 8 μg、连翘苷228.424 3 μg的对照品溶液。
2.2.3 供试品溶液的制备
取“1.2”项下连翘药材适量, 用装有不同规格筛网的破碎机破碎, 得不同规格的连翘饮片。按1 ∶ 1比例称取金银花、连翘饮片适量, 加水煎煮2次, 煎液用350目筛网滤过, 冷却, 精密量取续滤液10 mL, 置具塞锥形瓶中, 精密加入甲醇10 mL, 称定质量, 超声处理(功率300 W, 频率40 kHz) 30 min, 取出, 放冷, 再称定质量, 用50%甲醇补足损失的质量, 摇匀, 用0.22 μm的微孔滤膜滤过, 取续滤液, 即得。
2.2.4 专属性考察
分别精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液和“2.2.3”项下供试品溶液, 按“2.2.1”项下色谱条件测定。结果表明, 供试品溶液中各组分的色谱峰分离良好, 且7个指标成分的色谱峰均能与对照品参照物峰的保留时间相对应, 见图 5。
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图 5 供试品和对照品HPLC图注: A.金银花-连翘药对供试品溶液特征图谱; B~D.对照品特征图谱; 1.新绿原酸; 2.绿原酸; 3.隐绿原酸; 4.咖啡酸; 5.连翘酯苷A; 6.4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸; 7.连翘苷Figure 5. HPLC of test substance and reference substances2.2.5 线性关系考察
分别精密吸取“2.2.2”项下对照品溶液, 用甲醇稀释成不同质量浓度的系列混合对照品溶液, 按“2.2.1”项下色谱条件进行测定, 以对照品溶液浓度(X)为横坐标, 峰面积(Y)为纵坐标, 绘制标准曲线, 得线性回归方程, 结果见表 2。
表 2 各成分线性关系考察Table 2. Linear relationship investigation of compontents组分 回归方程 相关系数(r) 线性范围/(μg·mL-1) 新绿原酸 Y=10 524X-2 950.7 0.999 9 3.071~76.776 绿原酸 Y=13 228X-25 814 0.999 9 33.078~826.941 隐绿原酸 Y=11 080X-5 034.8 0.999 9 4.949~123.728 咖啡酸 Y=40 485X-3 206.6 0.999 9 1.998~49.950 连翘酯苷A Y=9 441.8X+32 643 0.999 9 42.343~1 058.585 4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸 Y=25 225X-4 685.5 0.999 9 6.242~156.059 连翘苷 Y=8 074.6X+12 605 0.999 9 9.137~228.424 2.2.6 精密度试验
取“2.2.3”项下供试品溶液, 按“2.1”项下色谱条件连续进样6次, 记录新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷A、4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷的峰面积, 计算各峰面积RSD值分别为0.70%、0.43%、0.43%、1.10%、0.34%、0.59%、0.43%, 表明仪器精密度良好。
2.2.7 稳定性试验
取“2.2.3”项下供试品溶液, 按“2.2.1”项下色谱条件, 分别在0、2、4、8、12、16、24 h进样, 记录新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷A、4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷的峰面积, 计算各峰面积RSD值分别为3.03%、2.77%、2.97%、4.51%、3.27%、2.97%、3.22%, 表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.2.8 重复性试验
取“2.2.3”项下供试品6份, 按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液, 并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定, 记录新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷A、4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷的峰面积, 计算其含量并计算RSD值分别为0.35%、0.66%、0.78%、0.68%、1.07%、1.91%、0.55%, 说明该方法重复性良好。
2.2.9 加样回收率试验
称取已知含量的金银花-连翘药对干浸膏粉6份，每份约0.1 g，精密称定，按供试品中指标成分量与加入对照品量之比1 ∶ 1原则, 分别加入适量的对照品溶液, 按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液, 并按“2.2.1”项下色谱条件进行测定, 测定供试品中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、连翘酯苷A、4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸、连翘苷的含量, 计算平均回收率分别为: 101.15%、93.33%、92.16%、106.04%、99.16%、102.85%、101.60%, RSD值分别为1.34%、1.15%、0.95%、0.32%、0.91%、2.76%、1.47%, 表明该方法回收率良好。
2.2.10 样品测定及提取率计算
将“2.2.3”项下制备的供试品溶液按“2.2.1”项下色谱条件进行测定, 并参照文献的方法计算提取率[8]。提取率=各指标成分质量/总投药量×100%。
2.3 出膏率测定
精密吸取金银花-连翘药对提取液25 mL, 置于已恒定质量的蒸发皿中, 在水浴上蒸干后, 于105 ℃干燥3 h, 置干燥器中冷却30 min, 迅速精密称定质量, 计算出膏率。
$$ \text { 出膏率 }=m V / 25 M \times 100 \% $$ m表示25 mL提取液的干浸膏质量, V表示提取液总体积, M表示提取药材质量。
2.4 CQAs和CPPs的确定
2.4.1 CQAs的确定
结合金银花、连翘单味药及金银花-连翘药对临床药理活性的研究, 将出膏率、酚酸类成分提取率(新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸提取率总和)、连翘酯苷A提取率、连翘苷提取率作为金银花-连翘药对提取工艺的CQAs。
2.4.2 CPPs的筛选
采用鱼骨图对关键工艺参数进行初步筛选, 见下图 6。根据前期实验研究, 可初步判饮片规格、提取时间、提取加水量为影响提取的关键因素。
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图 6 金银花-连翘药对水提取工艺筛选鱼骨图Figure 6. Fishbone diagram for water extraction process parameters of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae2.4.3 单因素试验
取“1.2”项下两味中药饮片(1 ∶ 1)适量, 固定提取时间, 连翘规格为整个、破碎1.5 cm、破碎1.0 cm、破碎0.8 cm、破碎0.5 cm进行不同饮片规格单因素考察。固定加水量, 提取时间分别为一煎20 min、二煎15 min, 一煎30 min、二煎30 min, 一煎60 min、二煎30 min, 一煎60 min、二煎60 min, 进行提取时间单因素考察, 结果见表 3~4。结果表明, 随着饮片规格的减小, 出膏率先增加后基本不变, 指标成分提取率先增加后降低; 随着提取时间的延长, 出膏率、指标成分提取率增加缓慢。结合金银花和连翘药物性质、酚酸类成分的热敏性质及生产实际情况, 确定金银花-连翘药对提取工艺考察最小规格为0.8 cm, 最长提取时间为一煎60 min、二煎30 min, 并参考《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》中有关加水量的说明, 确定最大加水倍数为一煎加12倍量水, 二煎加10倍量水。
表 3 单因素提取规格考察Table 3. Single factor extraction specification investigation提取规格/cm 提取率/% 出膏率/% 酚酸类成分 连翘酯苷A 连翘苷 整个 2.14 1.52 0.10 26.61 1.5 1.93 2.71 0.16 29.93 1.0 2.09 3.50 0.20 31.70 0.8 1.96 3.98 0.24 32.46 0.5 1.95 3.30 0.15 32.46 表 4 单因素提取时间考察Table 4. Single factor extraction time investigation提取时间/min 提取率/% 出膏率/% 酚酸类成分 连翘酯苷A 连翘苷 20+15 2.27 3.37 0.23 33.13 30+30 2.33 3.34 0.23 34.02 60+30 2.47 3.38 0.26 35.29 60+60 2.51 3.38 0.27 35.86 注: 30+30表示一煎煎煮30 min, 二煎煎煮30 min。 2.4.4 CQAs和CPPs的确定
基于以上单因素试验分析, 以出膏率(Y1)、酚酸类成分提取率(Y2)、连翘酯苷A提取率(Y3)、连翘苷提取率(Y4)作为水提取工艺考察的CQAs, 提取规格(X1)、提取时间(X2)、提取加水倍数(X3)作为水提取工艺考察的CPPs。
2.5 Box-Behnken试验
2.5.1 Box-Behnken试验设计
利用Design-Expert 11软件进行三因素三水平的17次试验, 其中中心点重复5次, 试验设计见表 5。
表 5 Box-Behnken实验工艺参数及水平设计与结果Table 5. Process parameters and levels design and results of Box-Behnken experiments试验号 因素 响应值 X1/cm X2/min X3 Y1/% Y2/% Y3/% Y4/% 1 1.0 60+30 12+10 35.63 2.45 3.34 0.28 2 1.5 30+30 10+8 32.31 2.32 3.03 0.21 3 1.0 60+30 10+8 33.62 2.13 3.03 0.23 4 1.0 30+30 11+9 33.81 2.34 3.42 0.25 5 0.8 20+15 11+9 33.07 2.23 3.54 0.24 6 1.5 60+30 11+9 34.59 2.41 3.11 0.26 7 1.0 30+30 11+9 34.20 2.30 3.36 0.24 8 1.0 20+15 12+10 33.92 2.32 3.50 0.24 9 0.8 30+30 10+8 33.51 2.29 3.57 0.24 10 1.0 30+30 11+9 34.48 2.26 3.29 0.24 11 1.0 20+15 10+8 32.21 2.24 3.17 0.22 12 1.0 30+30 11+9 34.18 2.31 3.33 0.24 13 1.5 30+30 12+10 33.50 2.35 3.17 0.24 14 1.0 30+30 11+9 34.17 2.29 3.30 0.24 15 0.8 60+30 11+9 34.81 2.29 3.32 0.28 16 0.8 30+30 12+10 34.57 2.39 3.62 0.26 17 1.5 20+15 11+9 32.32 2.26 2.90 0.20 注: 60+30表示一煎煎煮60 min, 二煎煎煮30 min; 12+10表示一煎加12倍量水, 二煎加10倍量水。 2.5.2 模型的建立与评价
采用二阶多项式模型对4个CQAs(Y1、Y2、Y3、Y4)及相应的CPP(X1、X2、X3)进行拟合, 建立回归方程如下: Y1=34.17-0.405 0X1+0.891 3X2+0.764 3X3+0.132 5X1X2+0.032 5X1X3+0.075 0X2X3-0.421 5X12-0.049 0X22-0.274 0X32; Y2=2.30+0.017 5X1+0.053 8X2+0.041 3X3+0.022 5X1X2-0.017 5X1X3+0.010 0X2X3+0.000 0X12-0.002 5X22+0.037 5X32; Y3=3.34-0.230 0X1-0.038 7X2+0.103 8X3+0.107 5X1X2+0.022 5X1X3-0.005 0X2X3-0.017 5X12-0.105 0X22+0.025 0X32; Y4=0.242 0-0.013 8X1+0.018 7X2+0.015 0X3+0.005 0X1X2+0.002 5X1X3+0.007 5X2X3-0.001 0X12+0.004 0X22-0.003 5X32。
二阶多项式拟合方程相关系数R2分别为0.943 1、0.871 0、0.926 3、0.935 4, 调整R2分别为0.869 9、0.705 0、0.831 6、0.852 4。方程的拟合相关系数R2均大于0.87, 表明该模型能解释大部分响应值的变化, 调整相关系数R2均大于0.70, 表明回归模型拟合度较好, 可以用该模型进行分析。
2.5.3 方差分析
采用Design-Expert 11软件对试验结果进行方差分析, 方差分析结果见表 6。
表 6 回归模型方差分析结果Table 6. ANOVA results of regression model来源 Y1 Y3 Y2 Y4 F P F P F P F P 模型 12.88 0.001 4 5.25 0.019 9 9.78 0.003 3 11.27 0.002 1 X1 11.38 0.011 9 2.37 0.167 3 60.12 0.000 1 23.27 0.001 9 X2 55.12 0.000 1 22.39 0.002 1 1.71 0.232 7 42.37 0.000 3 X3 38.64 0.000 4 13.19 0.008 4 12.23 0.010 0 27.69 0.001 2 X1X2 0.61 0.460 7 1.96 0.204 0 6.57 0.037 4 1.54 0.254 8 X1X3 0.04 0.853 6 1.19 0.312 0 0.29 0.608 3 0.39 0.554 8 X2X3 0.19 0.672 0 0.39 0.553 3 0.01 0.908 5 3.46 0.105 1 X12 6.49 0.038 3 0.00 1.000 0 0.18 0.681 5 0.06 0.806 4 X22 0.09 0.775 7 0.02 0.877 6 6.59 0.037 1 1.04 0.342 5 X32 2.74 0.141 7 5.74 0.047 8 0.37 0.560 2 0.79 0.402 6 失拟项 3.41 0.133 2 1.50 0.342 9 4.64 0.086 2 6.25 0.054 4 由表 6可以看出, 出膏率、酚酸类成分提取率、连翘酯苷A提取率、连翘苷提取率二项式回归模型方差均显著(P < 0.05), 失拟项不显著, 表明所建模型有统计学意义, 各因素与响应值之间可用此模型函数化。Y1、Y4项下X1、X2、X3的P值均小于0.05, 表明该三个因素对Y1、Y4均具有显著影响, Y2项下仅X2、X3的P值小于0.05, 表明X1对Y2无影响, 三个因素影响程度排序为X2>X3>X1, X1X2、X1X3、X2X3的P值均大于0.05, 表明三个因素的交互作用对Y1、Y2、Y4的影响不显著。Y3项下仅X1、X3的P值小于0.05, 表明X2对Y3无影响, 三个因素影响程度排序为X1>X3>X2, X1X3、X2X3的P值均大于0.05, 表明因素的交互作用对Y3的影响不显著, X1X2的P值为0.037 4, 小于0.05, 表明X1和X2的交互作用对Y3的影响较大。
2.5.4 响应面分析
用Design-Expert 11软件对Y1、Y2、Y3、Y4进行响应面分析, 等高线图及响应面图如图 7~10。由图可以直观看出, 各因素对Y1、Y2、Y4的影响大小排序为X2>X3>X1, 对Y3的影响大小排序为X1>X3>X2, 与方差分析结果一致。在规定范围内, 水量越大, 煎煮时间越短, 出膏率和酚酸类成分提取率越高, 这与固形物溶出率及酚酸类成分的不稳定性有关; 连翘酯苷A存在于连翘中, 易溶于水, 水量越大, 连翘规格越小, 连翘酯苷A越易溶出, 提取率则越高。
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图 7 出膏率的等高线及响应面图Figure 7. Contour analysis and response surface figure of content of extract rate![]()
图 8 酚酸类成分提取率的等高线及响应面图Figure 8. Contour analysis and response surface figure of the extraction rate of phenolic acids![]()
图 9 连翘酯苷A提取率的等高线及响应面图Figure 9. Contour analysis and response surface figure of the extraction rate of forsythoside A![]()
图 10 连翘苷提取率的等高线及响应面图Figure 10. Contour analysis and response surface figure of the extraction rate of forsythin运用Design-Expert 11软件优化所得金银花-连翘药对最佳水提取工艺为: 连翘规格为0.91 cm、提取加水量为一煎12倍量水、二煎10倍量水, 煎煮时间为一煎58.92 min、二煎29.46 min, 在此条件下, 出膏率为35.53%、酚酸类成分提取率为2.43%、连翘酯苷A提取率为3.38%、连翘苷提取率为0.29%。根据响应面结果及实际生产情况, 优化最佳水提取工艺为: 连翘规格为1.0 cm, 提取加水量为一煎12倍量水、二煎10倍量水, 煎煮时间为一煎60 min、二煎30 min。
2.6 设计空间的建立
2.6.1 设计空间的建立
生产实践表明, 中药制剂所含组分复杂, 变异来源较多, 实际生产中单一工艺操作模式具有一定的局限性, 不能很好地保证产品质量的均一稳定, 基于此, 通过上述模型预测的最佳提取工艺, 在设定的参数空间内寻找满足实验设计要求的最优化参数区域组合, 确定工艺参数范围, 即构成设计空间[17], 按此空间内的工艺参数进行生产, 可满足实际需要。前期研究表明, 该批次金银花-连翘药对基准样品出膏率为33.92%、酚酸类成分提取率为2.30%、连翘酯苷A提取率为3.32%、连翘苷提取率为0.24%, 且金银花-连翘药对水提液经浓缩干燥后出膏率及各指标成分含量均有不同程度的损失, 参考《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》《古代经典名方中药复方制剂基准物质的申报资料要求(征求意见稿)》中有关制剂质量与基准物质质量的一致性要求, 在下限70%的基础上加上成分损失率, 确定金银花-连翘药对出膏率大于33.92%、酚酸类成分提取率大于2.30%、连翘酯苷A提取率大于3.32%、连翘苷提取率大于0.24%, 以此为条件搜索符合目标的子集, 构建设计空间, 见图 11(Overlay plot 1)。但模型预测值与真实值存在一定的偏差, 所设空间的边界具有不确定性, 故在定义设计空间时加入置信水平α=0.05的置信区间, 对设计空间进行优化, 结果见图 11(Overlay plot 2), 浅灰色部分即为加入置信区间后矫正的设计空间, 在此空间内所有参数组合的预测值基本符合设定目标, 深灰色部分为未加入置信水平的不可靠部分, 即此空间内的预测值有5%概率不满足工艺目标要求。
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图 11 金银花-连翘药对水提取工艺设计空间Figure 11. Design space of water extract process of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae2.6.2 设计空间的验证
根据图 11中的设计空间范围, 固定提取加水倍量为一煎12倍量水、二煎10倍量水, 选取3个点进行设计空间的验证, 试验点选取见表 7, 试验结果见表 8。
表 7 设计空间验证试验点选取Table 7. Selection of experimental verification points for design space序号 X1/cm X2/min X3 试验点选取说明 YZ1 1.0 45+30 12+10 Y1、Y2、Y3、Y4均在95%置信区间内 YZ2 1.2 30+15 12+10 Y1、Y2、Y3、Y4部分在95%置信区间内, 部分在区间外 YZ3 1.5 20+15 12+10 Y1、Y2、Y3、Y4均不在95%置信区间内 注: 45+30表示一煎煎煮45 min, 二煎煎煮30 min; 12+10表示一煎加12倍量水, 二煎加10倍量水。 表 8 设计空间验证结果(%)Table 8. Results of verification test for design space(%)序号 Y1 Y2 Y3 Y4 预测值 实测值 预测值 实测值 预测值 实测值 预测值 实测值 YZ1 35.12 35.24 2.33 2.37 3.44 3.58 0.27 0.26 YZ2 33.98 34.32 2.26 2.21 3.42 3.63 0.24 0.26 YZ3 33.56 33.13 2.22 2.27 3.08 3.18 0.21 0.23 由验证试验结果可知, YZ1中各项均符合要求, YZ2中Y2未达到预设要求, YZ3均未达到要求, 表明由于95%置信区间的加入, 设计空间边界的不确定性得到了较好的印证, 所得模型是可靠、可应用的。
3. 讨论
中药药对是连接单味中药与经典复方的重要纽带, 目前多数单味中药或方剂提取工艺研究多采用醇提且进行提取次数考察, 与传统汤剂水煎煮2次不符, 本文在进行提取工艺研究时, 按传统汤剂煎煮模式, 直接以水为溶媒煎煮2次, 并参考《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》《古代经典名方中药复方制剂基准物质的申报资料要求(征求意见稿)》中有关基准物质煎煮工艺的要求结合实际提取工艺制备情况, 对饮片规格(连翘)、提取时间、提取加水量进行考察。同时采用网络药理学对金银花、连翘的活性成分进行初步筛选, 再结合《中国药典》2020年版金银花、连翘项下有关成分及相关文献检索, 最终选取抗菌、抗病毒、抗氧化的酚酸类成分(包括新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、4、5-二-O-咖啡酰奎宁酸)、苯乙醇类成分连翘酯苷A、木脂素类成分连翘苷作为有效化学成分指标, 同时出膏率也是评价提取工艺的重要指标, 因此选择出膏率、酚酸类成分提取率、连翘酯苷A提取率、连翘苷提取率作为金银花-连翘药对提取工艺考察的评价指标。
本研究基于质量源于设计理念, 通过Box-Behnken实验设计研究金银花-连翘药对CPP与CQA的相关性, 并建立金银花-连翘药对提取工艺的设计空间, 结合实际工业化大生产, 确定金银花-连翘药对水提取工艺参数操作空间为: 连翘提取饮片规格0.8~1.2 cm, 煎煮2次, 一煎加12倍量水提取30~50 min, 二煎加10倍量水提取25~30 min。经验证, 各项结果与预测结果基本一致, 大生产中可采用设计空间在原料药材质量发生波动或生产设备、生产条件变化的情况下达到工艺可调的目的, 保证产品质量的稳定与一致性, 做到安全有效、均一可控。通过设计空间的建立, 可以加深对金银花-连翘药对提取工艺的全面理解, 大大提升生产效率, 保证产品质量。
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图 1 金银花-连翘药对成分靶点与疾病靶点韦恩图
Figure 1. Venn diagram of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae components genes and disease genes
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图 2 金银花-连翘药对成分作用靶点GO功能分析
Figure 2. Analysis of GO function of ingredient action targets of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae
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图 3 金银花-连翘药对成分作用靶点KEGG通路富集分析的20条通路气泡图
Figure 3. 20-Channel bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae
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图 4 金银花-连翘药对药物-成分-靶点-通路相互作用网络图
注: 红色圆点代表药物; 绿色八边形代表成分; 紫色菱形代表靶点; 黄色三角形代表通路。
Figure 4. The interaction network diagram of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae drug-component-target-pathway
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图 5 供试品和对照品HPLC图
注: A.金银花-连翘药对供试品溶液特征图谱; B~D.对照品特征图谱; 1.新绿原酸; 2.绿原酸; 3.隐绿原酸; 4.咖啡酸; 5.连翘酯苷A; 6.4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸; 7.连翘苷
Figure 5. HPLC of test substance and reference substances
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图 6 金银花-连翘药对水提取工艺筛选鱼骨图
Figure 6. Fishbone diagram for water extraction process parameters of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae
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图 7 出膏率的等高线及响应面图
Figure 7. Contour analysis and response surface figure of content of extract rate
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图 8 酚酸类成分提取率的等高线及响应面图
Figure 8. Contour analysis and response surface figure of the extraction rate of phenolic acids
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图 9 连翘酯苷A提取率的等高线及响应面图
Figure 9. Contour analysis and response surface figure of the extraction rate of forsythoside A
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图 10 连翘苷提取率的等高线及响应面图
Figure 10. Contour analysis and response surface figure of the extraction rate of forsythin
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图 11 金银花-连翘药对水提取工艺设计空间
Figure 11. Design space of water extract process of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae
表 1 金银花-连翘药对主要活性成分基本信息
Table 1 The key active components of Flos Lonicerae-Fructus Forsythuae
组分 MOL ID 化合物 Pubchem CID OB/% DL/% 金银花 MOL000449 豆甾醇 5280794 43.83 0.76 MOL001494 Mandenol 5282184 42.00 0.19 MOL001495 亚麻酸乙酯 6371716 46.10 0.20 MOL002773 β-叶红素 5280489 37.18 0.58 MOL002914 Eriodyctiol(flavanone) 373261 41.35 0.24 MOL003006 (-)-(3R, 8S, 9R, 9aS, 10aS)-9-ethenyl-8-(beta-D-glucopyranosyloxy)-2, 3, 9, 9a, 10, 10a-hexahydro-5-oxo-5H, 8H-pyrano[4, 3-d]oxazolo[3, 2-a]pyridine-3-carboxylic acid_qt / 87.47 0.23 MOL003014 Secologanic dibutylacetal_qt / 53.65 0.29 MOL003036 ZINC03978781 11870462 43.83 0.76 MOL003044 Chryseriol 5280666 35.85 0.27 MOL003095 5-羟基-7-甲氧基-2-(3, 4, 5-三甲氧苯基)色酮 10970376 51.96 0.41 MOL003111 Centauroside_qt / 55.79 0.50 MOL003117 Ioniceracetalides B_qt / 61.19 0.19 MOL003128 Dinethylsecologanoside / 48.46 0.48 连翘 MOL000173 Wogonin 5281703 30.68 0.23 MOL000211 Mairin 64971 55.38 0.78 MOL000522 牛蒡子苷 100528 69.67 0.88 MOL000791 荷包牡丹碱 10237 81.25 0.57 MOL003283 (2R, 3R, 4S)-4-(4-Hydroxy-3-methoxy-phenyl)-7-methoxy-2, 3-dimethylol-tetralin-6-ol 160521 66.51 0.39 MOL003290 (3R, 4R)-3, 4-Bis[(3, 4-dimethoxyphenyl)methyl]oxolan-2-one 384877 52.30 0.48 MOL003295 (+)-松脂酚单甲基醚 / 53.08 0.57 MOL003305 连翘苷 24721571 36.40 0.86 MOL003306 ACon1_001697 21722915 85.12 0.57 MOL003308 (+)-松脂酚单甲基醚-4-D-β-葡萄糖苷 / 61.20 0.57 MOL003315 3Beta-acetyl-20, 25-epoxydammarane-24alpha-ol / 33.07 0.79 MOL003322 连翘酯醇 / 95.04 0.57 MOL003330 (-)-连翘脂素 3083590 42.06 0.74 MOL003347 Hyperforin 441298 44.03 0.61 MOL003370 Onjixanthone Ⅰ 5320290 34.45 0.84 共有及其它活性成分 MOL000006 木犀草素 5280445 36.16 0.25 MOL000098 槲皮素 5280343 46.43 0.28 MOL000358 β-谷甾醇 222284 36.91 0.75 MOL000414 咖啡酸 1549111 54.97 0.05 MOL000415 芦丁 5280805 3.20 0.68 MOL000422 山柰酚 5280863 41.88 0.24 MOL003065 隐绿原酸 9798666 10.48 0.33 MOL003066 新绿原酸 5280633 10.65 0.33 MOL003068 4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸 6474309 1.73 0.69 MOL003331 连翘酯苷A 5281773 3.05 0.61 MOL003871 绿原酸 1794427 13.61 0.31 
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表 2 各成分线性关系考察
Table 2 Linear relationship investigation of compontents
组分 回归方程 相关系数(r) 线性范围/(μg·mL-1) 新绿原酸 Y=10 524X-2 950.7 0.999 9 3.071~76.776 绿原酸 Y=13 228X-25 814 0.999 9 33.078~826.941 隐绿原酸 Y=11 080X-5 034.8 0.999 9 4.949~123.728 咖啡酸 Y=40 485X-3 206.6 0.999 9 1.998~49.950 连翘酯苷A Y=9 441.8X+32 643 0.999 9 42.343~1 058.585 4, 5-二-O-咖啡酰奎宁酸 Y=25 225X-4 685.5 0.999 9 6.242~156.059 连翘苷 Y=8 074.6X+12 605 0.999 9 9.137~228.424
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表 3 单因素提取规格考察
Table 3 Single factor extraction specification investigation
提取规格/cm 提取率/% 出膏率/% 酚酸类成分 连翘酯苷A 连翘苷 整个 2.14 1.52 0.10 26.61 1.5 1.93 2.71 0.16 29.93 1.0 2.09 3.50 0.20 31.70 0.8 1.96 3.98 0.24 32.46 0.5 1.95 3.30 0.15 32.46
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表 4 单因素提取时间考察
Table 4 Single factor extraction time investigation
提取时间/min 提取率/% 出膏率/% 酚酸类成分 连翘酯苷A 连翘苷 20+15 2.27 3.37 0.23 33.13 30+30 2.33 3.34 0.23 34.02 60+30 2.47 3.38 0.26 35.29 60+60 2.51 3.38 0.27 35.86 注: 30+30表示一煎煎煮30 min, 二煎煎煮30 min。
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表 5 Box-Behnken实验工艺参数及水平设计与结果
Table 5 Process parameters and levels design and results of Box-Behnken experiments
试验号 因素 响应值 X1/cm X2/min X3 Y1/% Y2/% Y3/% Y4/% 1 1.0 60+30 12+10 35.63 2.45 3.34 0.28 2 1.5 30+30 10+8 32.31 2.32 3.03 0.21 3 1.0 60+30 10+8 33.62 2.13 3.03 0.23 4 1.0 30+30 11+9 33.81 2.34 3.42 0.25 5 0.8 20+15 11+9 33.07 2.23 3.54 0.24 6 1.5 60+30 11+9 34.59 2.41 3.11 0.26 7 1.0 30+30 11+9 34.20 2.30 3.36 0.24 8 1.0 20+15 12+10 33.92 2.32 3.50 0.24 9 0.8 30+30 10+8 33.51 2.29 3.57 0.24 10 1.0 30+30 11+9 34.48 2.26 3.29 0.24 11 1.0 20+15 10+8 32.21 2.24 3.17 0.22 12 1.0 30+30 11+9 34.18 2.31 3.33 0.24 13 1.5 30+30 12+10 33.50 2.35 3.17 0.24 14 1.0 30+30 11+9 34.17 2.29 3.30 0.24 15 0.8 60+30 11+9 34.81 2.29 3.32 0.28 16 0.8 30+30 12+10 34.57 2.39 3.62 0.26 17 1.5 20+15 11+9 32.32 2.26 2.90 0.20 注: 60+30表示一煎煎煮60 min, 二煎煎煮30 min; 12+10表示一煎加12倍量水, 二煎加10倍量水。
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表 6 回归模型方差分析结果
Table 6 ANOVA results of regression model
来源 Y1 Y3 Y2 Y4 F P F P F P F P 模型 12.88 0.001 4 5.25 0.019 9 9.78 0.003 3 11.27 0.002 1 X1 11.38 0.011 9 2.37 0.167 3 60.12 0.000 1 23.27 0.001 9 X2 55.12 0.000 1 22.39 0.002 1 1.71 0.232 7 42.37 0.000 3 X3 38.64 0.000 4 13.19 0.008 4 12.23 0.010 0 27.69 0.001 2 X1X2 0.61 0.460 7 1.96 0.204 0 6.57 0.037 4 1.54 0.254 8 X1X3 0.04 0.853 6 1.19 0.312 0 0.29 0.608 3 0.39 0.554 8 X2X3 0.19 0.672 0 0.39 0.553 3 0.01 0.908 5 3.46 0.105 1 X12 6.49 0.038 3 0.00 1.000 0 0.18 0.681 5 0.06 0.806 4 X22 0.09 0.775 7 0.02 0.877 6 6.59 0.037 1 1.04 0.342 5 X32 2.74 0.141 7 5.74 0.047 8 0.37 0.560 2 0.79 0.402 6 失拟项 3.41 0.133 2 1.50 0.342 9 4.64 0.086 2 6.25 0.054 4
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表 7 设计空间验证试验点选取
Table 7 Selection of experimental verification points for design space
序号 X1/cm X2/min X3 试验点选取说明 YZ1 1.0 45+30 12+10 Y1、Y2、Y3、Y4均在95%置信区间内 YZ2 1.2 30+15 12+10 Y1、Y2、Y3、Y4部分在95%置信区间内, 部分在区间外 YZ3 1.5 20+15 12+10 Y1、Y2、Y3、Y4均不在95%置信区间内 注: 45+30表示一煎煎煮45 min, 二煎煎煮30 min; 12+10表示一煎加12倍量水, 二煎加10倍量水。
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表 8 设计空间验证结果(%)
Table 8 Results of verification test for design space(%)
序号 Y1 Y2 Y3 Y4 预测值 实测值 预测值 实测值 预测值 实测值 预测值 实测值 YZ1 35.12 35.24 2.33 2.37 3.44 3.58 0.27 0.26 YZ2 33.98 34.32 2.26 2.21 3.42 3.63 0.24 0.26 YZ3 33.56 33.13 2.22 2.27 3.08 3.18 0.21 0.23
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